本文關(guān)鍵詞：黃瓜“mango”突變體分析與基因功能研究

  更多相關(guān)文章： 黃瓜 “mango”突變體 CsWOX1 CsWUS 花發(fā)育

【摘要】：黃瓜花性型分化多樣,已成為研究植物性型分化的模式植物。花器官發(fā)育的調(diào)控研究由來已久,調(diào)控關(guān)鍵因子的挖掘也是研究的主要內(nèi)容。黃瓜“mango”突變體由于其雌、雄花發(fā)育異常,成為進(jìn)一步研究花器官發(fā)育調(diào)控的重要材料。主要研究結(jié)果如下:1.對突變體及野生型植株各部位形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn),與野生型黃瓜相比,“mango”突變體幼苗期子葉皺縮不平展;第一、二片真葉楔形且不平展,從第三片真葉開始,主葉脈伸出;雌、雄花花瓣均變窄,雄蕊花藥組織退化,不能產(chǎn)生花粉,表現(xiàn)為雄性不育;雌蕊子房細(xì)長,柱頭部分融合,溫室栽培環(huán)境下不能授粉、結(jié)實(shí);開放的環(huán)境下可以授粉、結(jié)實(shí),但結(jié)實(shí)率極低,果實(shí)外形似芒果,因此得名“mango”突變。對葉片及不同發(fā)育時期雌花、雄花進(jìn)行組織切片觀察發(fā)現(xiàn),突變體葉片柵欄組織、維管組織排列不規(guī)律,葉片表皮細(xì)胞不平滑,單位面積細(xì)胞數(shù)目減少;雄花發(fā)育過程中,花藥室及花粉發(fā)育受到抑制;雌花發(fā)育過程中,胚珠發(fā)育異常,子房膨大受到限制。2.前期工作中對突變體候選基因進(jìn)行了圖位克隆,并將候選基因最終定位于第1染色體長臂約16.7kb區(qū)間內(nèi),對該區(qū)間內(nèi)候選基因進(jìn)行預(yù)測分析后發(fā)現(xiàn)只有一個功能基因?yàn)镃sa1M042780,基因編碼WUSCHEL-related homeobox1蛋白,與擬南芥中AtWOX1基因同源,將該基因命名為CsWOX1。進(jìn)一步分析表明該基因?qū)儆赪OX轉(zhuǎn)錄因子家族成員,突變產(chǎn)生的原因是該基因第四號外顯子缺失一個核苷酸,造成移碼突變,翻譯提前終止,使得編碼蛋白短截且丟失WUS-box保守序列。隨后在野生型及突變體材料頂芽、雌花、雄花、葉片、根等組織進(jìn)行CsWOX1/Cswox1基因特異性表達(dá)分析后發(fā)現(xiàn),突變后Cswox1基因表達(dá)量顯著升高。由此推測,突變體的產(chǎn)生可能是CsWOX1蛋白結(jié)構(gòu)改變或是其突變后基因上調(diào)表達(dá)引起。3.為進(jìn)一步探明突變體產(chǎn)生的原因,將CsWOX1/Cswox1基因分別置于35S過表達(dá)啟動子下進(jìn)行擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化,對陽性轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行表型分析后發(fā)現(xiàn),CsWOX1及Cswox1過表達(dá)對擬南芥花器官的形態(tài)及植株育性有一定影響,但兩個轉(zhuǎn)基因系的陽性株在表型上無明顯差異,進(jìn)一步說明在過表達(dá)情況下CsWOX1與Cswox1基因功能無差異。由此可推知,黃瓜“mango”突變表型的產(chǎn)生可能是Cswox1基因上調(diào)表達(dá)引起,雖然WUS-box保守序列缺失,但蛋白結(jié)構(gòu)的改變可能不是植株突變的主要因素。4.在突變體與野生型材料四葉一心時期取頂芽進(jìn)行RNA-seq分析,結(jié)果表明,差異基因的轉(zhuǎn)錄組分類分析中,WOX轉(zhuǎn)錄因子家族基因只有WOX1及WUS基因,由此可知黃瓜WUS與WOX1基因?qū)π刍òl(fā)育調(diào)控非常重要。結(jié)合擬南芥WUS相關(guān)基因及調(diào)控機(jī)制,進(jìn)一步分析RNA-Seq數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)黃瓜雄花發(fā)育中也可能存在與擬南芥WUS基因相似的調(diào)控通路,黃瓜中主要包括的基因有:CsWUS,CsAG,CsSPL/CsNZZ,CsMYB33,CsDYT1,Cs AMS,CsMYB103,CsMS1,這些同源基因的表達(dá)模式與擬南芥相似。對黃瓜子房發(fā)育中CsWOX1,CsWUS,CsAG,CsSPL/CsNZZ進(jìn)行表達(dá)分析后發(fā)現(xiàn),突變體中Cswox1基因表達(dá)上調(diào)后CsWUS,CsAG,CsSPL/CsNZZ基因表達(dá)嚴(yán)重下調(diào),與雄花中相應(yīng)基因表達(dá)模式一致。由此可知,在黃瓜花器官發(fā)育進(jìn)程中,WUS基因參與的調(diào)控通路與擬南芥相似,但在擬南芥中AtWOX1與At WUS基因之間尚且沒有明確的調(diào)控關(guān)系研究,而從RNA-seq分析后發(fā)現(xiàn),黃瓜wox1可以抑制WUS基因的表達(dá)。綜上結(jié)果,“mango”突變表型的產(chǎn)生可能是由Cswox1基因表達(dá)上調(diào)后抑制CsWUS及其相關(guān)基因的表達(dá)引起。
【關(guān)鍵詞】：黃瓜 “mango”突變體 CsWOX1 CsWUS 花發(fā)育
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S642.2
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-12
• 第一章 文獻(xiàn)綜述12-20
• 1.1 研究背景12-14
• 1.1.1 黃瓜的生物學(xué)特性12
• 1.1.2 黃瓜突變體研究進(jìn)展12-14
• 1.1.2.1 黃瓜突變體的獲得12-13
• 1.1.2.2 黃瓜突變體的主要類型13-14
• 1.2 “mango”突變體候選基因的圖位克隆14-15
• 1.2.1 “mango”突變體的來源及表型特征14-15
• 1.2.2 “mango”突變體基因的圖位克隆15
• 1.3 WOX轉(zhuǎn)錄因子家族研究進(jìn)展15-19
• 1.3.1 WOX轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)15-16
• 1.3.2 WOX轉(zhuǎn)錄因子研究進(jìn)展16-19
• 1.4 本研究的目的意義和主要內(nèi)容19-20
• 1.4.1 本研究的目的和意義19
• 1.4.2 本研究的主要內(nèi)容19-20
• 第二章 黃瓜CsWOX1基因的克隆及功能分析20-42
• 2.1 材料與方法20-25
• 2.1.1 試驗(yàn)材料20-21
• 2.1.1.1 植物材料20
• 2.1.1.2 質(zhì)粒和菌株20
• 2.1.1.3 主要試劑與儀器20
• 2.1.1.4 引物20-21
• 2.1.2 試驗(yàn)方法21-25
• 2.1.2.1 黃瓜AM218野生型與突變體植株表型觀察與分析21-22
• 2.1.2.2 CsWOX1基因相關(guān)生物信息學(xué)分析22-23
• 2.1.2.3 CsWOX1、Cswox1基因在不同組織的表達(dá)分析23
• 2.1.2.4 CsWOX1、Cswox1原核表達(dá)分析23-25
• 2.1.2.5 CsWOX1、Cswox1目標(biāo)蛋白的亞細(xì)胞定位分析25
• 2.2 數(shù)據(jù)處理25
• 2.3 結(jié)果與分析25-40
• 2.3.1 野生型與突變體材組織觀察分析25-31
• 2.3.1.1 突變體與野生型植物學(xué)特性觀察與分析26-28
• 2.3.1.2 突變體與野生型葉片組織結(jié)構(gòu)觀察與分析28-29
• 2.3.1.3 雌、雄花芽不同發(fā)育時期的石蠟切片觀察29-31
• 2.3.2 CsWOX1基因相關(guān)生物信息學(xué)分析31-36
• 2.3.2.1 CsWOX1與擬南芥WOX蛋白家族序列比對31-33
• 2.3.2.2 黃瓜CsWOX1基因突變位點(diǎn)分析33
• 2.3.2.3 CsWOX1蛋白理化性質(zhì)及氨基酸序列分析33-34
• 2.3.2.4 CsWOX1、Cswox1亞細(xì)胞定位分析及蛋白質(zhì)功能分類34-36
• 2.3.3 CsWOX1、Cswox1基因在野生型及突變體植株的表達(dá)分析36-37
• 2.3.4 CsWOX1、Cswox1基因編碼蛋白的原核表達(dá)分析37-38
• 2.3.4.1 重組質(zhì)粒的酶切鑒定37
• 2.3.4.2 CsWOX1、Cswox1原核表達(dá)及分析37-38
• 2.3.5 CsWOX1、Cswox1目標(biāo)蛋白的亞細(xì)胞定位分析38-40
• 2.3.5.1 P_(35S):: CsWOX1-GFP、P_(35S):: Cswox1-GFP重組載體的鑒定38-39
• 2.3.5.2 報(bào)告基因GFP在洋蔥表皮細(xì)胞中的分布39-40
• 2.4 討論40-42
• 第三章 黃瓜轉(zhuǎn)錄因子CsWOX1在擬南芥發(fā)育中的功能研究42-50
• 3.1 材料與方法42-44
• 3.1.1 材料42-43
• 3.1.1.1 植物材料42
• 3.1.1.2 質(zhì)粒和菌株42
• 3.1.1.3 試驗(yàn)相關(guān)引物42-43
• 3.1.2 試驗(yàn)方法43-44
• 3.1.2.1 黃瓜CsWOX1、Cswox1基因CDS序列克隆43
• 3.1.2.2 P_(35s):: CsWOX1-GUS、P_(35s):: Cswox1-GUS融合載體的構(gòu)建43
• 3.1.2.3 黃瓜CsWOX1、Cswox1基因在擬南芥中的過表達(dá)43
• 3.1.2.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株表型觀察與分析43-44
• 3.2 結(jié)果與分析44-48
• 3.2.1 轉(zhuǎn)基因擬南芥表型觀察與分析44-48
• 3.2.1.1 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株表型觀察44-46
• 3.2.1.2 M31、W44 轉(zhuǎn)基因擬南芥花粉畸形率測定46-47
• 3.2.1.3 轉(zhuǎn)基因擬南芥平均果莢長度及種子量統(tǒng)計(jì)分析47-48
• 3.3 討論48-50
• 第四章 黃瓜野生型及突變體轉(zhuǎn)錄組測序分析50-59
• 4.1 材料與方法50-52
• 4.1.1 材料50
• 4.1.2 試驗(yàn)方法50
• 4.1.2.1 RNA-Seq測序及分析50
• 4.1.2.2 子房發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)分析50
• 4.1.3 試驗(yàn)相關(guān)引物50-52
• 4.2 結(jié)果與分析52-58
• 4.2.1 測序結(jié)果52-57
• 4.2.1.1 RNA測序質(zhì)量評估52
• 4.2.1.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)果簡況52-53
• 4.2.1.3 RNA-seq差異基因的qPCR驗(yàn)證53-54
• 4.2.1.4 差異基因的GO富集分析54-55
• 4.2.1.5 差異基因的KEGG分析55-56
• 4.2.1.6 差異基因中轉(zhuǎn)錄因子家族分析56-57
• 4.2.2 野生型與突變體子房發(fā)育WUS相關(guān)基因表達(dá)分析57-58
• 4.3 討論58-59
• 結(jié)論59-60
• 參考文獻(xiàn)60-64
• 附錄64-69
• 致謝69-70
• 作者簡介70

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本文編號：1066008