本文關(guān)鍵詞：農(nóng)桿菌介導(dǎo)的MsWRKY11基因?qū)Υ蠖沟倪z傳轉(zhuǎn)化研究

  更多相關(guān)文章： 農(nóng)桿菌介導(dǎo) 大豆 MsWRKY11基因 耐鹽

【摘要】：大豆是植物蛋白及植物油的主要來源。許多非生物脅迫均會導(dǎo)致大豆產(chǎn)量減少、品質(zhì)下降等不良后果。利用基因工程技術(shù)培育抗逆性良好的轉(zhuǎn)基因大豆新品系,以求能夠使我國鹽漬土地資源得到充分應(yīng)用,滿足我國對大豆產(chǎn)量與品質(zhì)不斷增長的需求,具有十分重要的研究意義與發(fā)展前景。WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物生長發(fā)育及對脅迫環(huán)境的抵抗過程中起著十分重要的作用。本研究從耐鹽性較好的紫花苜蓿中克隆得到MsWRKY11基因,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù),將其轉(zhuǎn)入大豆。對T2代PCR陽性植株進(jìn)行鹽處理,并測定與耐逆相關(guān)的生理指標(biāo),分析MsWRKY11基因?qū)μ岣叽蠖鼓望}性的作用,以期獲得耐鹽性較好的轉(zhuǎn)基因大豆株系。主要研究結(jié)果如下:1.MsWRKY11基因的克隆與序列分析以紫花苜蓿mRNA為模板,克隆了紫花苜�；騇sWRKY11。該基因開放讀碼框全長945個核苷酸,編碼314個氨基酸。對MsWRKY11基因表達(dá)產(chǎn)物的氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn),該蛋白具有一個鋅指結(jié)構(gòu)域和一個WRKY結(jié)構(gòu)域,是典型的WRKY家族成員,與蒺藜苜蓿、大豆、鷹嘴豆等物種的親緣關(guān)系較近。2.MsWRKY11基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建構(gòu)建了MsWRKY11基因的植物表達(dá)載體pTF101.1-MsWRKY11,含CaMV35S啟動子和篩選標(biāo)記Bar基因,并將植株表達(dá)載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌菌株EHA101中,用于大豆遺傳轉(zhuǎn)化。3.MsWRKY11基因?qū)Υ蠖沟倪z傳轉(zhuǎn)化以東農(nóng)50作為轉(zhuǎn)基因植物受體,通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對大豆子葉節(jié)進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,共得到39株T0代大豆苗,其中草丁膦抗性植株16株,PCR陽性為10株;40株T1代中草丁膦抗性植株20株,PCR陽性植株為8株;590株T2代植株中草丁膦抗性植株156株,PCR陽性植株為83株。4.轉(zhuǎn)MsWRKY11基因大豆的鹽脅迫耐受性分析及生理指標(biāo)檢測對表達(dá)量較高的3個轉(zhuǎn)MsWRKY11基因大豆株系(TR 1-1、TR 2-2、TR 7-1)與野生型進(jìn)行200mM NaCl處理,觀察其表型并測定其抗逆生理指標(biāo)。結(jié)果表明,在鹽脅迫下,轉(zhuǎn)基因大豆較野生型有更好的生長狀態(tài)。轉(zhuǎn)基因株系的葉綠素含量較野生型下降量少,丙二醛含量、相對電導(dǎo)率均比野生型低,保護(hù)酶活性均明顯高于野生型植株。
【關(guān)鍵詞】：農(nóng)桿菌介導(dǎo) 大豆 MsWRKY11基因 耐鹽
【學(xué)位授予單位】：哈爾濱師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S565.1;Q943.2
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-9
• 第一章 緒論9-15
• 1.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆的遺傳轉(zhuǎn)化9-12
• 1.2 植物轉(zhuǎn)錄因子WRKY家族的結(jié)構(gòu)及功能12-13
• 1.3 本研究的目的和意義13-15
• 第二章 Ms WRKY11基因的克隆及植物表達(dá)載體的構(gòu)建15-37
• 2.1 引言15
• 2.2 材料和方法15-25
• 2.2.1 實驗材料15-18
• 2.2.2 實驗方法18-25
• 2.3 結(jié)果與分析25-35
• 2.3.1 紫花苜�？俁NA提取及c DNA檢測25-27
• 2.3.2 Ms WRKY11基因克隆27
• 2.3.3 p MD18T-Ms WRKY11克隆載體的構(gòu)建27-29
• 2.3.4 Ms WRKY11基因序列的生物信息學(xué)分析29-33
• 2.3.5 表達(dá)載體p TF101.1-Ms WRKY11構(gòu)建33-35
• 2.3.6 植物表達(dá)載體p TF101.1-Ms WRKY11轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌35
• 2.4 本章小結(jié)35-37
• 第三章 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Ms WRKY11基因?qū)Υ蠖沟倪z傳轉(zhuǎn)化37-51
• 3.1 引言37
• 3.2 材料和方法37-45
• 3.2.1 實驗材料37
• 3.2.2 實驗儀器與藥品37-39
• 3.2.3 培養(yǎng)基的配置39-41
• 3.2.4 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆遺傳轉(zhuǎn)化41-42
• 3.2.5 轉(zhuǎn)基因大豆葉片小量DNA的提取（CTAB法）42-43
• 3.2.6 轉(zhuǎn)基因大豆DNA的PCR鑒定43-45
• 3.2.7 轉(zhuǎn)基因大豆q RT-PCR檢測45
• 3.3 結(jié)果與分析：45-50
• 3.3.1 Ms WRKY11基因?qū)Υ蠖沟倪z傳轉(zhuǎn)化及抗性植株的獲得45-47
• 3.3.2 抗性植株的分子生物學(xué)檢測47-49
• 3.3.3 轉(zhuǎn)基因大豆T2代q RT-PCR檢測49-50
• 3.4 本章小結(jié)50-51
• 第四章 轉(zhuǎn)Ms WRKY11基因大豆T2代表型及生理分析51-66
• 4.1 引言51
• 4.2 材料與方法51-56
• 4.2.1 實驗材料51
• 4.2.2 實驗方法51-56
• 4.3 結(jié)果與分析56-65
• 4.3.1 轉(zhuǎn)基因大豆葉片鹽脅迫處理(葉盤法）56-57
• 4.3.2 轉(zhuǎn)Ms WRKY11基因大豆T2代表型分析57-59
• 4.3.3 轉(zhuǎn)Ms WRKY11基因大豆T2代葉綠素含量變化59
• 4.3.4 轉(zhuǎn)Ms WRKY11基因大豆T2代相對電導(dǎo)率變化59-60
• 4.3.5 轉(zhuǎn)Ms WRKY11基因大豆T2代丙二醛（MOD）含量變化60-61
• 4.3.6 轉(zhuǎn)Ms WRKY11基因大豆T2代游離脯氨酸（Pro）和可溶性糖含量變化61-63
• 4.3.7 轉(zhuǎn)Ms WRKY11基因大豆T2代超氧化物歧化酶（SOD）活性變化63
• 4.3.8 轉(zhuǎn)Ms WRKY11基因大豆T2代過氧化物酶（POD）活性變化63-64
• 4.3.9 轉(zhuǎn)Ms WRKY11基因大豆T2代過氧化氫酶（CAT）酶活性變化64-65
• 4.4 本章小結(jié)65-66
• 第五章 討論66-69
• 5.1 土地鹽化對大豆的影響66
• 5.2 Ms WRKY11基因的分離與鑒定66
• 5.3 Ms WRKY11基因在增加轉(zhuǎn)基因大豆耐鹽性中的作用66-68
• 5.4 下一步工作計劃68-69
• 結(jié)論69-70
• 參考文獻(xiàn)70-76
• 致謝76-77

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