本文關(guān)鍵詞：Kurthiahuakuii漆酶基因的克隆表達(dá)、蛋白純化與酶學(xué)特性研究

  更多相關(guān)文章： Kurthia huakuii LAM0618T 類漆酶 原核表達(dá) 酶學(xué)特性 耐熱 耐酸 染料脫色

【摘要】：漆酶由于能夠催化氧化各種酚類和非酚類芳香化合物成水,漆酶被廣泛用于合成染料的脫色和脫毒。Kurthia屬菌株對三苯甲烷染料和紡織染料廢水具有出色的脫色性能。根據(jù)Kurthia huakuii LAM0618T基因組注釋的結(jié)果,并基于生物信息學(xué)的分析,本文克隆了一個類漆酶基因laclK,并對laclK的原核表達(dá),重組LaclK的酶學(xué)特性及其在染料脫色方面開展了一系列研究。主要結(jié)論如下:(1)成功構(gòu)建了E.coli BL21(DE3)/pET28a-laclK表達(dá)菌株。(2)通過IPTG、銅離子以及溫度梯度誘導(dǎo),確定了LaclK誘導(dǎo)表達(dá)的最優(yōu)條件,為0.2 mM IPTG和0.5 mM Cu2+低溫16℃誘導(dǎo)。咪唑梯度洗脫確定了重組LaclK最佳的洗脫濃度,為300mM。(3)結(jié)構(gòu)性質(zhì):光譜學(xué)分析表明LaclK在610 nm和330 nm處未出現(xiàn)漆酶特征吸收峰。銅含量測定表明LaclK只含有1個銅離子。(4)酶學(xué)特性:LaclK最適反應(yīng)溫度為65℃,60℃、pH2.5條件下保持6 d酶活無損失,80℃半衰期83 h。LaclK是發(fā)現(xiàn)最耐熱的酚氧化酶類。LaclK能夠催化常見漆酶底物ABTS、2,6-DMP和L-多巴胺。以ABTS、2,6-DMP、L-多巴胺為底物時最適pH分別為2.5、7.0和6.0。LaclK在酸性條件下和中性偏堿性條件下(pH 2.0~9.0)都具有酶活,尤其在酸性條件下(p H 2.5)具有很高的穩(wěn)定性。銅離子對LaclK發(fā)揮酶活性是必要的,0.2 mM的Cu2+濃度使LaclK酶活達(dá)到最高。1 mmol的Mg2+,Pb2+,K+,Co2+和Ca2+能促進(jìn)酶活,而1 mmol的Mn2+,Fe2+,Zn2+和Ag+對LaclK具有抑制作用。LaclK具有很好的有機(jī)試劑耐受能力,10%(v/v)的甲醇、乙醇、異丙醇、丁醇、曲拉通X-100和二甲基亞砜都能促進(jìn)酶活。L-Cys、EDTA、DTT以及SDS是酶的強(qiáng)抑制劑。LaclK的催化常數(shù)Kcat與某些報道的多銅氧化酶很接近,但是比典型的細(xì)菌漆酶低了兩個數(shù)量級左右。LaclK的結(jié)構(gòu)特點和底物特異性表明LaclK為類漆酶多酚氧化酶。(5)染料脫色:LaclK能夠在中性偏堿性條件下脫色多種測試的染料,脫色性能優(yōu)良,在介體ABTS參與下,60℃反應(yīng)1 h,60 U/L的LaclK對25μM的維多利亞藍(lán)B和乙基紫的脫色率分別達(dá)到92%和94%。此外,LaclK還擁有一定的鹵化物和有機(jī)試劑耐受性,在染料廢水的生物修復(fù)中具有一定的應(yīng)用潛力。
【關(guān)鍵詞】：Kurthia huakuii LAM0618T 類漆酶 原核表達(dá) 酶學(xué)特性 耐熱 耐酸 染料脫色
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q55;Q78
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-12
• 英文縮略表12-13
• 第一章 緒論13-19
• 1.1 漆酶的種類13-14
• 1.1.1 植物漆酶13
• 1.1.2 昆蟲漆酶13-14
• 1.1.3 真菌漆酶14
• 1.1.4 細(xì)菌漆酶14
• 1.2 細(xì)菌漆酶研究進(jìn)展14-17
• 1.2.1 細(xì)菌漆酶的結(jié)構(gòu)特征14-15
• 1.2.2 細(xì)菌漆酶催化的底物15
• 1.2.3 細(xì)菌漆酶的催化機(jī)理15-16
• 1.2.4 細(xì)菌漆酶的應(yīng)用前景16-17
• 1.2.4.1 降解環(huán)境污染物16
• 1.2.4.2 脫色有色工業(yè)廢水16-17
• 1.2.4.3 生物制漿17
• 1.2.4.4 食品飲料工業(yè)17
• 1.2.4.5 生物傳感器17
• 1.3 研究目的及內(nèi)容17-19
• 1.3.1 研究目的及意義17-18
• 1.3.2 研究內(nèi)容18-19
• 第二章 生物信息學(xué)分析19-27
• 2.1 分析方法19
• 2.2 分析結(jié)果19-26
• 2.2.1 核苷酸和氨基酸序列分析19-20
• 2.2.2 LaclK保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測20-22
• 2.2.3 LaclK蛋白信號肽分析及跨膜區(qū)域的預(yù)測22-23
• 2.2.4 LaclK蛋白的一級結(jié)構(gòu)23-24
• 2.2.5 LaclK二級結(jié)構(gòu)預(yù)測24
• 2.2.6 LaclK三級結(jié)構(gòu)預(yù)測24-25
• 2.2.7 脂肪族氨基酸指數(shù)和不穩(wěn)定性系數(shù)的分析25-26
• 2.3 本章小結(jié)26-27
• 第三章 原核表達(dá)菌株構(gòu)建27-34
• 3.1 實驗材料和方法27-30
• 3.1.1 實驗材料27-28
• 3.1.2 試驗方法28-30
• 3.2 結(jié)果與討論30-33
• 3.2.1 laclK基因的擴(kuò)增30-31
• 3.2.2 pET-28a質(zhì)粒的提取與BamH I和Xho I雙酶切驗證31-32
• 3.2.3 表達(dá)系統(tǒng)E. coli BL21(DE3)/pET28a-laclK的構(gòu)建和測序驗證32-33
• 3.3 本章小結(jié)33-34
• 第四章 重組LaclK的表達(dá)和純化34-42
• 4.1 材料和方法34-37
• 4.1.1 試驗材料34
• 4.1.2 試驗方法34-37
• 4.2 結(jié)果與討論37-41
• 4.2.1 BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立37-38
• 4.2.2 重組LaclK的表達(dá)條件38-40
• 4.2.3 LaclK蛋白的純化40-41
• 4.3 本章小結(jié)41-42
• 第五章 LaclK酶學(xué)性質(zhì)研究42-51
• 5.1 實驗材料與方法42-44
• 5.1.1 實驗材料42
• 5.1.2 實驗方法42-44
• 5.2 結(jié)果與討論44-50
• 5.2.1 LaclK的理化特征44-45
• 5.2.2 LaclK的酶促反應(yīng)動力學(xué)45-49
• 5.2.3 LaclK的動力學(xué)常數(shù)49-50
• 5.3 本章小結(jié)50-51
• 第六章 LaclK對染料的脫色研究51-59
• 6.1 實驗材料和方法51-52
• 6.1.1 實驗材料51
• 6.1.2 實驗方法51-52
• 6.2 結(jié)果與討論52-58
• 6.2.1 LaclK的制備與酶活的測定52-53
• 6.2.2 LaclK對不同結(jié)構(gòu)染料的脫色53-54
• 6.2.3 LaclK對乙基紫脫色的研究54-58
• 6.2.3.1 給酶量對乙基紫脫色的影響55
• 6.2.3.2 接種時間對乙基紫脫色的影響55
• 6.2.3.3 乙基紫濃度對脫色的影響55-56
• 6.2.3.4 pH對乙基紫脫色的影響56
• 6.2.3.5 鹵離子對乙基紫脫色的影響56-57
• 6.2.3.6 有機(jī)試劑對乙基紫脫色的影響57
• 6.2.3.7 NO~(3?)，，SO_4~(2?) 和腐殖酸對乙基紫脫色的影響57-58
• 6.3 本章小結(jié)58-59
• 第七章 全文結(jié)論及展望59-61
• 7.1 結(jié)論59
• 7.2 展望59-61
• 參考文獻(xiàn)61-68
• 附錄68-70
• 致謝70-71
• 作者簡歷71-72

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前6條

1 高鍵;關(guān)可興;焦晶;姜文洙;張應(yīng)玖;;細(xì)菌漆酶的結(jié)構(gòu)、催化性能及其應(yīng)用[J];分子催化;2014年02期

2 于孟蘭;倪金鳳;;昆蟲漆酶的研究進(jìn)展[J];生物加工過程;2014年01期

3 杜東霞;;漆酶的特性及其在工業(yè)中的應(yīng)用[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2011年04期

4 Kyoung-Sook Kim;Jai-Heon Lee;Young-Choon Lee;;Cloning,expression in Escherichia coli,and enzymatic properties of laccase from Aeromonas hydrophila WL-11[J];Journal of Environmental Sciences;2010年04期

5 張培培;任隨周;許玫英;孫國萍;;微生物對三苯基甲烷類染料脫色的研究進(jìn)展[J];微生物學(xué)通報;2009年09期

6 王歲樓,王瓊波;漆酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用及其產(chǎn)生菌的研究[J];食品科學(xué);2005年02期

本文編號：1060639