本文關(guān)鍵詞：雞傳染性法氏囊病病毒NB株VP2成熟蛋白基因在畢赤酵母中的表達(dá)

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【摘要】：傳染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus,IBDV)感染雞導(dǎo)致傳染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease,IBD),主要以侵害雛雞淋巴組織,特別是中樞免疫器官——法氏囊,導(dǎo)致機(jī)體的免疫抑制。近年來,由于各地IBDV變異株、超強(qiáng)毒株的出現(xiàn),使該病出現(xiàn)新的特點(diǎn),傳統(tǒng)疫苗免疫不能夠進(jìn)行有效防控。VP2是IBDV主要結(jié)構(gòu)蛋白,包含主要保護(hù)性抗原表位。因此,VP2重組蛋白的表達(dá)能夠?yàn)镮BDV的防治和診斷試劑的開發(fā)提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。本研究根據(jù)GenBank中已發(fā)表的IBDV NB株VP2蛋白基因序列,結(jié)合蛋白成熟過程中VP2的裂解位點(diǎn)和抗原集中區(qū)的分析,設(shè)計(jì)合成VP2成熟蛋白基因引物,以IBDV VP2的cDNA為模板,PCR擴(kuò)增VP2成熟片段,并與pMD18-T-simple載體連接,構(gòu)建pMD-VP2重組克隆質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化至DH5α,通過菌液PCR、雙酶切和基因測(cè)序篩選陽性克隆。然后,利用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和KpnⅠ,雙酶切陽性重組克隆質(zhì)粒pMD-VP2、真核表達(dá)載體pPICZαC,回收目的基因,T4 DNA連接酶進(jìn)行連接,構(gòu)建pPICZαC-VP2真核重組表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化至DH5α。利用菌液PCR、雙酶切和基因測(cè)序篩選陽性重組表達(dá)質(zhì)粒,成功構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒,命名為pPICZαC-VP2,PmeⅠ線性化陽性重組表達(dá)質(zhì)粒,電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至畢赤酵母X-33中。ZeocinTM抗性篩選和菌液PCR,篩選獲得陽性重組子,接種于BMMY培養(yǎng)基后用甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng),SDS-PAGE分析和Western blotting鑒定重組蛋白。研究結(jié)果顯示,擴(kuò)增出長(zhǎng)度為1323bp的VP2成熟蛋白基因。甲醇誘導(dǎo)重組真核表達(dá)質(zhì)粒,SDS-PAGE檢測(cè)顯示在60KDa處有一條比理論值偏大的條帶;Western blotting鑒定,重組蛋白能夠與IBDV陽性血清特異性結(jié)合。以上研究結(jié)果表明,本研究成功獲得了IBDV VP2重組蛋白。
【關(guān)鍵詞】：傳染性法氏囊病病毒 VP2成熟蛋白 畢赤酵母
【學(xué)位授予單位】：河南科技學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.65
【目錄】：

• 縮略詞表8-10
• 摘要10-11
• ABSTRACT11-12
• 第一章 文獻(xiàn)綜述12-22
• 1 IBD臨床癥狀與致病機(jī)理12-13
• 1.1 IBD臨床癥狀12
• 1.2 IBDV致病機(jī)理12-13
• 2 IBDV基因組結(jié)構(gòu)13
• 3 IBDV衣殼蛋白13-15
• 3.1 VP2蛋白13-14
• 3.2 VP3蛋白14
• 3.3 VP4蛋白14-15
• 3.4 VP5蛋白15
• 3.5 VP1蛋白15
• 4 IBDV VP2抗原結(jié)構(gòu)的變異15-16
• 5 IBDV疫苗研究進(jìn)展16-17
• 5.1 傳統(tǒng)IBDV疫苗16
• 5.2 基因工程苗16-17
• 6 IBDV VP2蛋白在不同表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)17-18
• 6.1 IBDV VP2在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)17
• 6.2 IBDV VP2在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)17-18
• 6.3 IBDV VP2在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)18
• 7 存在問題及防治前景18-19
• 8 研究目的與意義19-22
• 第二章 IBDV NB株VP2成熟蛋白基因在畢赤酵母中的表達(dá)22-60
• 1 材料22-29
• 1.1 菌種和質(zhì)粒22
• 1.2 試劑盒22-23
• 1.3 抗體23
• 1.4 酶類及其它相關(guān)試劑23-24
• 1.5 主要儀器設(shè)備24-25
• 1.6 主要試劑的配制25-27
• 1.7 蛋白凝膠電泳及Western blotting緩沖液27-29
• 2 方法29-43
• 2.1 IBDV VP2基因的擴(kuò)增29-32
• 2.2 IBDV NB株VP2基因重組克隆質(zhì)粒的構(gòu)建32-36
• 2.3 IBDV NB株VP2基因畢赤酵母表達(dá)載體構(gòu)建36-39
• 2.4 重組陽性質(zhì)粒pPICZαC-VP2轉(zhuǎn)化X-33酵母菌39-43
• 3 結(jié)果與分析43-53
• 3.1 IBDV VP2基因片段的PCR擴(kuò)增43
• 3.2 回收純化VP2基因43-44
• 3.3 IBDV NB株VP2基因克隆載體的構(gòu)建及鑒定44-45
• 3.4 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建45-48
• 3.5 重組質(zhì)粒pPICZαC-VP2的線性化鑒定48-49
• 3.6 重組酵母菌菌液PCR鑒定49-50
• 3.7 表達(dá)產(chǎn)物的分析及鑒定50-53
• 4 討論53-60
• 4.1 引物設(shè)計(jì)53
• 4.2 抗原集中區(qū)對(duì)抗原活性的影響53
• 4.3 VP2重組蛋白的檢測(cè)53-54
• 4.4 酵母表達(dá)系統(tǒng)54
• 4.5 影響外源基因在畢赤酵母中表達(dá)的幾個(gè)因素54-60
• 全文結(jié)論60-62
• 參考文獻(xiàn)62-70
• 附錄A 表達(dá)載體pPICZαC的物理圖譜70-72
• 附錄B 表達(dá)載體pPICZαC的多克隆位點(diǎn)72-74
• 攻讀學(xué)位期間取得的研究成果74-76
• 致謝76

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