本文關(guān)鍵詞：褐飛虱細(xì)胞色素單加氧酶基因的功能分析

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【摘要】：細(xì)胞色素單加氧酶(P450)酶系又稱作多功能氧化酶(MFO),是一類代謝酶并且廣泛存在于所有需氧生物體,它可以催化和調(diào)控內(nèi)源物質(zhì)和外源物質(zhì)的代謝與轉(zhuǎn)化。在昆蟲中約有100個左右的P450基因,它們的作用廣泛,昆蟲對殺蟲劑有抗藥性和對植物有毒物質(zhì)有耐受性是因為P450基因能對異源物質(zhì)有代謝作用。此外P450還參與了昆蟲體內(nèi)兩大激素保幼激素、蛻皮激素的合成與代謝。本研究以褐飛虱作為研究對象,通過篩選基因組及轉(zhuǎn)錄組,共鑒定到68條P450序列。我們著重對CYP2亞家族進(jìn)行了功能分析。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示CYP18A1、CYP304H1基因在褐飛虱的整個若蟲期內(nèi)均有表達(dá),且表達(dá)量隨齡期逐漸升高,但CYP303A1基因則與前兩個基因相反,整個若蟲期內(nèi)均有表達(dá),且表達(dá)量隨齡期逐漸降低。這三個基因在褐飛虱的成蟲體內(nèi)表達(dá)量不高；CYP18A1基因在褐飛虱的翅芽中表達(dá)量最高,其次是卵巢,體壁。CYP304H1基因在褐飛虱的脂肪體中表達(dá)量最高,其次是唾液腺。CYP303A1在體壁和翅芽中表達(dá)量非常高。對5齡第一天的若蟲進(jìn)行顯微注射dsCYP18A1、dsCYP304H1、 dsCYP303A1, mRNA可被有效下調(diào),褐飛虱5齡若蟲的體壁以及蛻皮過程均呈現(xiàn)不同程度的畸形表型,且干擾這三個基因都會使褐飛虱致死；對這三個基因干擾分別干擾3齡、4齡、5齡的褐飛虱若蟲,統(tǒng)計三個齡期死亡率,結(jié)果顯示三個基因?qū)诛w虱的不同齡期均致死。通過CYP304H1轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),克隆CYP304H1基因片段大小為522bp,可編碼含174個氨基酸殘基的蛋白,預(yù)測分子量為22.3kDa。通過原核表達(dá),回收蛋白制備了CYP304H1蛋白的多克隆抗體。本結(jié)果首次發(fā)現(xiàn)了褐飛虱CYP304H1對昆蟲蛻皮,及體壁發(fā)育功能具有重要影響,為進(jìn)一步研究昆蟲P450參與蛻皮激素和保幼激素合成打下基礎(chǔ)；同時,利用RNAi技術(shù)成功干擾基因表達(dá),褐飛虱不能正常蛻皮及體壁畸形,可以作為褐飛虱防治的潛在靶標(biāo)基因,這對褐飛虱的遷飛和防治都具有潛在價值。
【關(guān)鍵詞】：褐飛虱 P450 RNAi
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S435.112.3
【目錄】：

• 致謝7-8
• 摘要8-9
• Abstract9-14
• 第一章 文獻(xiàn)綜述14-24
• 1.1 褐飛虱的危害14
• 1.2 細(xì)胞色素P450概述14-23
• 1.2.1 昆蟲細(xì)胞色素P450概述15
• 1.2.2 昆蟲細(xì)胞色素P450基因功能15-23
• 1.3 本研究的意義23-24
• 第二章 褐飛虱CYP18A1、CYP304H1、CYP303A1基因的序列分析24-38
• 2.1 材料與方法25
• 2.1.1 實驗材料25
• 2.2 常用試劑25-27
• 2.2.1 工具酶及試劑盒25
• 2.2.2 SDS-PAGE試劑25-26
• 2.2.3 Western blot試劑26
• 2.2.4 其它試劑26-27
• 2.3 常用方法27-30
• 2.3.1 CaCl_2法制備感受態(tài)細(xì)胞27
• 2.3.2 褐飛虱總RNA的提取27-28
• 2.3.3 反轉(zhuǎn)錄28
• 2.3.4 連接轉(zhuǎn)化反應(yīng)28
• 2.3.5 質(zhì)粒抽提28-29
• 2.3.6 膠回收29
• 2.3.7 PCR反應(yīng)29
• 2.3.8 CYP18A1、CYP304H1、CYP303A1基因的生物信息分析29-30
• 2.4 結(jié)果分析30-36
• 2.4.1 CYP18A1、CYP304H1、CYP303A1基因的Scaffold分析30-31
• 2.4.2 序列同源性分析31-36
• 2.5 討論36-38
• 第三章 CYP18A1、CYP304H1、CYP303A1基因的表達(dá)特性38-46
• 3.1 材料與方法38-40
• 3.1.1 材料38
• 3.1.2 方法38-40
• 3.2 結(jié)果與分析40-44
• 3.2.1 CYP304H1在卵、若蟲期和成蟲的表達(dá)量40-41
• 3.2.2 CYP18A1在卵、若蟲期和成蟲的表達(dá)量41
• 3.2.3 CYP303A1在卵、若蟲期和成蟲的表達(dá)量41-42
• 3.2.4 CYP304H1基因在褐飛虱不同組織中的表達(dá)差異42-43
• 3.2.5 CYP18A1基因在褐飛虱不同組織中的表達(dá)差異43-44
• 3.2.6 CYP303A1基因在褐飛虱不同組織中的表達(dá)差異44
• 3.3 討論44-46
• 第四章 褐飛虱CYP18A1、CYP304H1、CYP303A1基因的RNAi46-64
• 4.1 材料和方法46-47
• 4.1.1 材料46-47
• 4.1.2 實驗試劑47
• 4.1.3 引物設(shè)計47
• 4.2 方法47-49
• 4.2.1 體外合成dsRNA47-49
• 4.3 結(jié)果與分析49-62
• 4.3.1 目的基因合成效果圖49-50
• 4.3.2 目的基因的干擾效果50-52
• 4.3.3 目的基因干擾后表型變化52-55
• 4.3.4 目的基因干擾后死亡率55-62
• 4.4 討論62-64
• 第五章 褐飛虱P450基因CYP304H1原核表達(dá)及多克隆抗體制備64-70
• 5.1 材料與方法64-65
• 5.1.1 材料64-65
• 5.2 實驗方法65-67
• 5.2.1 基本操作方法65-67
• 5.3 結(jié)果與分析67-68
• 5.3.1 原核表達(dá)載體構(gòu)建67-68
• 5.3.2 表達(dá)產(chǎn)物Western blot鑒定及多克隆抗體的制備68
• 5.4 討論68-70
• 總結(jié)70-72
• 參考文獻(xiàn)72-82
• 在讀期間發(fā)表的論文82

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本文編號：1042295