發(fā)布時(shí)間：2017-10-15 11:04

  本文關(guān)鍵詞：木薯類受體胞質(zhì)激酶基因MeBIK1的分離鑒定

  更多相關(guān)文章： 木薯 MeBIK1 遺傳互補(bǔ) 功能鑒定 遺傳轉(zhuǎn)化

【摘要】：木薯是熱帶地區(qū)重要的糧食作物,同時(shí)也是一種重要的能源作物。由黃單胞桿菌引起的細(xì)菌性枯萎病是世界各木薯主產(chǎn)國的檢疫性病害,嚴(yán)重影響木薯產(chǎn)量的提高。先天免疫反應(yīng)(innate immunity)是植物應(yīng)答病原物的基礎(chǔ)抗性,具有廣譜性、持久性,是有效開展植物抗病育種的新選擇。對木薯先天免疫相關(guān)基因的分離鑒定將有助于完善木薯與病原微生物互作理論知識,同時(shí)抗性新基因的獲得也將為木薯抗病育種提供新的基因資源。本研究根據(jù)擬南芥PTI反應(yīng)途徑關(guān)鍵基因AtBIK1(LOC_ At2g39660)的氨基酸序列,對木薯基因組進(jìn)行同源搜索,候選了木薯類受體蛋白激酶基因并通過表達(dá)分析、功能缺失性突變體遺傳互補(bǔ)、轉(zhuǎn)基因等途徑對該基因的功能進(jìn)行研究。取得的主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：1. 利用擬南芥已知研究結(jié)果,對木薯釋放的基因組數(shù)據(jù)庫(www.cassava.org)進(jìn)行同源搜索,候選了木薯PTI途徑類受體蛋白胞質(zhì)激酶基因,序列分析結(jié)果表明,該基因cDNA全長1230 bp,所擴(kuò)增的基因與已釋放序列同源性100%,編碼409個(gè)氨基酸,含有保守的激酶結(jié)構(gòu)域,鑒于該基因與擬南芥AtBIK1高度同源,命名為MeBIK1.2. 擬南芥原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)體系亞細(xì)胞定位結(jié)果表明,MeBIK1基因定位在細(xì)胞膜上。3. qRT-PCR結(jié)果表明,MeBIK1基因在未受刺激時(shí)表達(dá)量低,受到鞭毛蛋白flg22刺激后表達(dá)量顯著提高,并在刺激后1h表達(dá)量最高,之后逐漸降低。4. 構(gòu)建MeBIK1基因雙元熒光素酶報(bào)告系統(tǒng),利用擬南芥atbik1突變體開展遺傳互補(bǔ)實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明,MeBIKl基因能恢復(fù)擬南芥atbik1突變體中減弱的PTI反應(yīng)。5. 構(gòu)建了MeBIKl基因的植物過量表達(dá)載體進(jìn)行擬南芥轉(zhuǎn)基因,經(jīng)潮霉素多次篩選獲得純合子后進(jìn)行抗病性測定,結(jié)果表明,過表達(dá)植株能提高轉(zhuǎn)基因擬南芥對XamHN04(黃單胞桿菌)的抗性,但對PstDC3000的敏感性。6. 采用2,4-D和picloram不同濃度對木薯華南8號進(jìn)行體細(xì)胞胚誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)picloram 12 mg/L時(shí)體細(xì)胞胚的出胚率最高為83.3%。之后用picloram不同濃度分別誘導(dǎo)TMS60444、SC6、SC8、SC124和Arg7 5個(gè)木薯品種的體細(xì)胞胚、成熟胚以及愈傷組織,結(jié)果表明5個(gè)品種中TMS60444的出胚率最高達(dá)到89.2%,其次是SC8,為83.3%。7. 采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化木薯FEC,設(shè)定了農(nóng)桿菌菌液濃度和浸染時(shí)間兩個(gè)轉(zhuǎn)化條件,經(jīng)潮霉素篩選后發(fā)現(xiàn)菌液濃度OD600=0.4、浸染時(shí)間為30 min時(shí)FEC的存活率最高。8. 采用gus染色對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行檢測結(jié)果表明,57株再生植株中有48株植株的的莖和葉都被染上藍(lán)色,將染色陽性的植株進(jìn)行基因組PCR檢查,發(fā)現(xiàn)有均能擴(kuò)增出400bp左右的條帶,陽性率為84%.10.利用MeBIK1-gfp引物擴(kuò)增經(jīng)抗性篩選后4植株葉片基因組DNA,結(jié)果有2株擴(kuò)增出了目的條帶,陽性率率為50%。
【關(guān)鍵詞】：木薯 MeBIK1 遺傳互補(bǔ) 功能鑒定 遺傳轉(zhuǎn)化
【學(xué)位授予單位】：海南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q943.2;S533
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 第一章 前言11-22
• 1 木薯生產(chǎn)現(xiàn)狀11-12
• 1.1 木薯栽培現(xiàn)狀11
• 1.2 木薯的經(jīng)濟(jì)價(jià)值及用途11-12
• 1.3 病害是制約木薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素之一12
• 2 植物先天免疫反應(yīng)12-17
• 2.1 病原物的PAMPs和植物的PRRs13-14
• 2.2 PAMPs激活的免疫信號通路14-15
• 2.3 BIKI在植物先天免疫的激活與調(diào)控中必不可少15-17
• 3 木薯的組織培養(yǎng)及遺傳轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)展17-20
• 3.1 木薯的組織培養(yǎng)17-19
• 3.1.1 分生組織培養(yǎng)18
• 3.1.2 成熟器官培養(yǎng)18-19
• 3.1.3 體細(xì)胞胚狀體培養(yǎng)19
• 3.2 木薯的遺傳轉(zhuǎn)化19-20
• 3.2.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的木薯遺傳轉(zhuǎn)化20
• 3.2.2 基于FEC的轉(zhuǎn)化體系20
• 4 本研究的目的和研究內(nèi)容20-21
• 5 技術(shù)路線21-22
• 第二章 木薯類受體激酶基因MEBIK1的分離及在擬南芥中的功能鑒定22-39
• 1 材料與方法22-29
• 1.1 試驗(yàn)材料22-24
• 1.1.1 植物材料22
• 1.1.2 菌株及載體22
• 1.1.3 主要試劑22
• 1.1.4 儀器設(shè)備22
• 1.1.5 原生質(zhì)體提取及轉(zhuǎn)化所用試劑22-23
• 1.1.6 培養(yǎng)基23-24
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法24-29
• 1.2.1 木薯葉片總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄24
• 1.2.2 RT-PCR擴(kuò)增MeBIK1基因的全長CDs序列24-25
• 1.2.3 候選基因的誘導(dǎo)表達(dá)分析25
• 1.2.4 載體構(gòu)建25-26
• 1.2.5 氯化銫密度梯度離心法大量提取質(zhì)粒26-27
• 1.2.6 擬南芥原生質(zhì)體制備及亞細(xì)胞定位分析27-28
• 1.2.7 擬南芥同源基因缺失突變體的遺傳互補(bǔ)28
• 1.2.8 轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得及鑒定28-29
• 1.2.9 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的抗病性檢測29
• 2 結(jié)果與分析29-37
• 2.1 木薯葉片總RNA提取29
• 2.2 候選基因MeBIK1編碼一個(gè)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶29-31
• 2.3 MeBIK1定位在細(xì)胞膜上31-32
• 2.4 MeBIK1基因受Flg22誘導(dǎo)表達(dá)32-33
• 2.5 MeBIK1能恢復(fù)擬南芥突變體的PTI反應(yīng)33-34
• 2.6 轉(zhuǎn)MeBIK1基因擬南芥的獲得及表達(dá)檢測34-35
• 2.7 轉(zhuǎn)基因擬南芥抗病表型鑒定35-37
• 3 討論37-39
• 3.1 MeBIK1是一個(gè)類受體胞質(zhì)激酶37-38
• 3.2 MeBIK1在抗PstDC300和XamHN004中的表型不一致38-39
• 第三章 木薯遺傳轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建及轉(zhuǎn)MEBIK1基因植株的獲得39-53
• 1 材料與方法39-42
• 1.1 材料39-40
• 1.1.1 植物材料39
• 1.1.2 菌株及載體39
• 1.1.3 藥品試劑39
• 1.1.4 培養(yǎng)基39-40
• 1.2 方法40-42
• 1.2.1 木薯無菌苗的獲得40
• 1.2.2 腋芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)40
• 1.2.3 體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)以及成熟40
• 1.2.4 不同濃度picloram誘導(dǎo)不同木薯品種體細(xì)胞胚的產(chǎn)生40-41
• 1.2.5 脆性胚性愈傷組織(FEC)的誘導(dǎo)41
• 1.2.6 植株再生41
• 1.2.7 報(bào)告基因pCAMBIA1301-gus及目的基因MeBIK的轉(zhuǎn)化41
• 1.2.8 轉(zhuǎn)化后植株的再生41-42
• 1.2.9 轉(zhuǎn)基因植株的鑒定42
• 2 結(jié)果與分析42-51
• 2.1 不同濃度2,4-D和picloram對誘導(dǎo)體細(xì)胞胚的影響42-44
• 2.1.1 2,4-D的不同濃度對誘導(dǎo)體細(xì)胞胚的影響42-43
• 2.1.2 picloram的不同濃度對誘導(dǎo)體細(xì)胞胚的影響43-44
• 2.2 五個(gè)木薯品種在picloram不同濃度下體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)情況44-45
• 2.3 誘導(dǎo)成熟脆性胚性愈傷FEC的最佳picloram濃度的篩選45-46
• 2.4 農(nóng)桿菌菌液濃度和侵染時(shí)間對木薯FEC存活率的影響46
• 2.5 轉(zhuǎn)化植株的再生46-48
• 2.6 轉(zhuǎn)基因木薯植株的鑒定48-51
• 2.6.1 報(bào)告基因的gus染色及PCR檢測48-49
• 2.6.2 目的基因MeBIK1的熒光檢測49-50
• 2.6.3 目的基因MeBIK1的PCR檢測50-51
• 3 討論51-53
• 3.1 生長素濃度對木薯體細(xì)胞胚產(chǎn)量差異較大51
• 3.2 轉(zhuǎn)化時(shí)間及菌液濃度對FEC存活率有較大影響51-53
• 第四章 結(jié)論53-54
• 參考文獻(xiàn)54-59
• 附錄59-63
• 附錄一59
• 附錄二59
• 附錄三59-61
• 附錄四61-63
• 發(fā)表的文章63
• 致謝63

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 郝叢叢;鄭會(huì)欣;賈嬌;司賀龍;陳展;趙斌;張靖;邢繼紅;董金皋;;擬南芥T1N6_22在抵抗Pst DC3000侵染過程中的功能分析[J];中國農(nóng)業(yè)科學(xué);2013年04期

2 Kranthi Kumar Gadidasu;;Cassava Genetic Transformation and its Application in Breeding[J];Journal of Integrative Plant Biology;2011年07期

3 朱文麗;莫饒;李開綿;王文泉;;激素對木薯體細(xì)胞胚胎發(fā)生與植株再生的影響[J];熱帶作物學(xué)報(bào);2010年04期

4 劉曉峰;梁春麗;李莉;;克菌靈P308在木薯燃料乙醇微酸發(fā)酵中的應(yīng)用[J];山東食品發(fā)酵;2009年02期

5 梁于朝;朱德明;匡鈺;韓志萍;李開綿;;擠壓膨化技術(shù)應(yīng)用于木薯生產(chǎn)燃料酒精的初步研究[J];食品研究與開發(fā);2009年07期

6 尹彩霞;喬愛民;張鵬;張繼棟;吳志;;木薯組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因育種研究進(jìn)展[J];仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院學(xué)報(bào);2009年02期

7 許瑞麗;黃潔;李開綿;葉劍秋;張振文;陸小靜;;良好操作規(guī)范的木薯栽培技術(shù)[J];廣東農(nóng)業(yè)科學(xué);2009年03期

8 岑貞陸;黃思良;;木薯抗細(xì)菌性枯萎病鑒定技術(shù)初報(bào)[J];作物雜志;2008年06期

9 盧明;北海市木薯細(xì)菌性枯萎病的發(fā)生為害特點(diǎn)及防治對策[J];廣西植保;2005年01期

10 李洪清,李美茹,梁承鄴;影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)的木薯基因轉(zhuǎn)化因素的研究[J];實(shí)驗(yàn)生物學(xué)報(bào);1999年04期

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 農(nóng)艷豐;農(nóng)桿菌介導(dǎo)木薯“新選048”遺傳轉(zhuǎn)化體系的初步建立[D];廣西大學(xué);2014年

，

本文編號：1036747