發(fā)布時間：2020-03-18 21:58

【摘要】：在化石能源儲量不斷減少、環(huán)境壓力不斷凸顯的雙重壓力下,充分利用木質(zhì)纖維素等可再生資源來開發(fā)清潔能源受到舉世關(guān)注。氫能是目前已知最為清潔的可再生能源,在氫氣的生產(chǎn)方式中,以木質(zhì)纖維素原料為基質(zhì)進行微生物暗發(fā)酵產(chǎn)氫是重要的途徑之一,這其中發(fā)酵菌種的選擇至關(guān)重要。然而,自然界中,單一野生菌株發(fā)酵產(chǎn)氫的氫產(chǎn)量相對較低,因此在很長時期,研究工作多集中于高效產(chǎn)氫菌種的篩選上。同時,秸稈類生物質(zhì)原料中的木質(zhì)纖維素或其水解物的成分較復(fù)雜,木糖往往不能為產(chǎn)氫細菌所利用,為此,篩選能水解木質(zhì)纖維素或代謝木糖的產(chǎn)氫菌株,顯得尤為重要。棉稈是新疆分布最廣泛的生物質(zhì)原料,年產(chǎn)量可達數(shù)百萬噸。近年來棉稈的高值化利用備受關(guān)注,棉稈高值化產(chǎn)品的開發(fā)也呈現(xiàn)多樣化,已有研究報道能將棉稈水解糖液發(fā)酵轉(zhuǎn)化為高值化產(chǎn)品,如乙醇、木糖醇、單細胞油脂等。然而,極少有關(guān)于產(chǎn)氫細菌發(fā)酵棉稈水解糖液合成生物氫的報道。為獲得能高效發(fā)酵棉稈水解糖液合成生物氫的產(chǎn)氫細菌,本論文從塔里木流域野生鯉魚腸道分離、篩選獲得一株產(chǎn)氫細菌Klebsiella sp.WL1316,用其發(fā)酵棉稈水解糖液產(chǎn)氫,對其發(fā)酵條件進行篩選,并對發(fā)酵過程進行放大和調(diào)控,實現(xiàn)了棉稈水解糖液中木糖和葡萄糖的共利用,獲得了高的生物氫產(chǎn)量。進一步基于Klebsiellasp.WL1316的基因組信息,重構(gòu)了菌株兼具葡萄糖、木糖利用和發(fā)酵產(chǎn)氫的代謝網(wǎng)絡(luò),結(jié)合對發(fā)酵產(chǎn)氫過程中關(guān)鍵酶和關(guān)鍵節(jié)點代謝物的代謝通量分析,闡明了菌株發(fā)酵產(chǎn)氫的代謝基礎(chǔ)。具體研究內(nèi)容如下:1.從塔里木河流域野生鯉魚腸道分離、篩選獲得一株產(chǎn)氫細菌WL1316,經(jīng)形態(tài)、生理生化及16SrDNA序列鑒定為Klebsiellasp.。研究發(fā)現(xiàn)該菌具備共利用葡萄糖和木糖發(fā)酵產(chǎn)氫的能力,其以棉稈水解糖液為糖基質(zhì),發(fā)酵24 h的產(chǎn)氫量、產(chǎn)氫速率和氫產(chǎn)率分別可達554.0 ± 22.6 mL/L、23.1 ± 0.9 mL/(L·h)、0.33 ± 0.01 mL/(L.mol sugarconsumed),表明該菌株具備利用棉稈水解糖液高效合成生物氫的潛力。進一步確定該菌株最佳的發(fā)酵條件為:起始糖濃度40 g/L,發(fā)酵溫度37℃,發(fā)酵起始pH值8.0,在此發(fā)酵條件下,采用修正的Gompertz方程擬合累積產(chǎn)氫量的動力學(xué)參數(shù)Rm值與P值均達到最大,表明Klebsiella sp.WL1316具有較高的發(fā)酵產(chǎn)氫速率和產(chǎn)氫潛力。2.基于已獲得的Klebsiella sp.WL1316發(fā)酵棉稈水解糖液產(chǎn)氫的最佳發(fā)酵條件,在5 L發(fā)酵罐中開展了放大實驗,獲得了更高的產(chǎn)氫生產(chǎn)力:最大日均產(chǎn)氫量達937.0 ± 41.0 mL/(L.d),累積產(chǎn)氫量達2908.5 ± 47.4 mL/L,活菌計數(shù)達(20.2±0.6)×108 CFU/mL,生物氫產(chǎn)率達1.44±0.08 mol/molsugarconsumed,同時也獲得了較高的葡萄糖和木糖利用率,表明該菌株具備較強的將棉稈水解糖液中的葡萄糖和木糖轉(zhuǎn)化為生物氫的能力。分段調(diào)控pH值處理可有效緩解發(fā)酵液中由于酸性代謝物產(chǎn)生引起的pH值急劇降低,顯著提高菌株的日均產(chǎn)氫量和累積產(chǎn)氫量,促進葡萄糖和木糖的利用及菌株的生長。相較而言,分段控溫處理并不能顯著提高菌株的日均產(chǎn)氫量和累積產(chǎn)氫量,但卻可在一定程度上促進葡萄糖和木糖的利用及菌株的生長。3.對產(chǎn)氫細菌Klebsiella sp.WL1316進行了全基因組測序,基于基因組注釋結(jié)果,從菌株比對的KEGG代謝途徑中獲得了菌株利用葡萄糖的主要代謝途徑,及以丙酮酸為中間代謝物的發(fā)酵產(chǎn)氫途徑。進一步對基于COG分類的功能蛋白進行分析,發(fā)現(xiàn)木糖通過異構(gòu)化為木酮糖,并進一步磷酸化為木酮糖-5-磷酸,進入磷酸戊糖途徑進行代謝。此外,該菌株還具有多樣的氫酶和甲酸氫裂解酶功能蛋白,且在數(shù)量分布上優(yōu)于一些近緣屬的細菌。在此基礎(chǔ)上,重構(gòu)了菌株兼具葡萄糖、木糖利用和發(fā)酵產(chǎn)氫的代謝網(wǎng)絡(luò)。基于重構(gòu)的代謝網(wǎng)絡(luò),檢測并分析了Klebsiellasp.WL1316生物氫合成關(guān)鍵代謝支路的酶活性,并對關(guān)鍵節(jié)點代謝物進行了代謝通量分析。結(jié)果顯示發(fā)酵周期內(nèi)葡萄糖及木糖有效得到代謝,推動了菌株細胞物質(zhì)的合成和發(fā)酵途徑的進行。發(fā)酵24 h,丙酮酸快速進行脫羧轉(zhuǎn)化,為其它代謝支路提供了碳骨架。在發(fā)酵48 h后,甲酸大量裂解用于生物氫合成,但在24～48 h階段丙酮酸節(jié)點的代謝流部分流向三羧酸循環(huán)。在發(fā)酵48～72 h,乳酸合成支路成為主要競爭支路。在72 h之后,乙酸和乙醇合成的代謝支路在發(fā)酵后期對生物氫合成起到了較主要的競爭作用�；跀M穩(wěn)態(tài)構(gòu)建的菌株發(fā)酵產(chǎn)氫過程代謝網(wǎng)絡(luò)亦證明了上述代謝過程�；谏鲜龇治�,可認為在發(fā)酵中后期(48～96h),需要較好地調(diào)控生物氫合成的競爭支路才能有效提高生物氫產(chǎn)量。
【圖文】：

實現(xiàn)不同水平上對暗發(fā)酵產(chǎn)氫過程進行有效調(diào)控。逡逑最典型的暗發(fā)酵產(chǎn)氫代謝途徑主要有兩條：一是以梭菌屬為代表的專性厭氧菌的逡逑丁酸發(fā)酵途徑（圖１－２），，另一是以腸桿菌屬為代表的兼性厭氧菌的混合酸發(fā)酵途徑（圖逡逑１－３）。在丁酸發(fā)酵途徑中，可通過敲除基因阻斷丙酮酸生產(chǎn)乳酸的支路、敲除逡逑冰７基因阻斷生產(chǎn)甲酸的支路、敲除ａｃｔ聲ａ基因阻斷乙酰ＣｏＡ生成乙酸的支路、敲逡逑除似基因阻斷乙酰ＣｏＡ生成乙酰乙酰ＣｏＡ的支路、敲除五基因阻斷乙酰ＣｏＡ生逡逑產(chǎn)乙醇的支路、敲除吸氫酶基因或超量表達一些酶基因，在基因水平上實現(xiàn)產(chǎn)氫代謝逡逑途徑的調(diào)控，從而提高生物氫產(chǎn)量。Ｌｉ等（２０１０）敲除了嗜熱厭氧桿菌逡逑ＴＴｚｅ削似ｅ邋中的邋基因，使l#的產(chǎn)量提尚了邋２邋倍［１３２］。Ｌｉｕ逡逑等（２００６）通過基因敲除使酪丁酸梭菌中編碼ｉ酸激酶的ａｏｆｅ基因失活，使氫產(chǎn)量提逡逑高了邋１．５邋倍［１３３］。Ｓｏｏ邋等（２０１７）在邐ｃｏ／／邋ＳＳ１邋中分別同源表達／基因、逡逑異源表達梭菌辦必基因，氫產(chǎn)量相較野生型菌株分別提高了邋４１％、２０％［１３４］。Ｍｏｒｉｍｏｔｏ逡逑等（２００５）在梭菌Ｃ／ｏｒｆｒｚＷ／ｗｍ／ｗｍ／ｗｒｒｉ／ｆｃ灥Ｍ－２１中超量表達辦必基因，提高了氧逡逑產(chǎn)量

實現(xiàn)不同水平上對暗發(fā)酵產(chǎn)氫過程進行有效調(diào)控。逡逑最典型的暗發(fā)酵產(chǎn)氫代謝途徑主要有兩條：一是以梭菌屬為代表的專性厭氧菌的逡逑丁酸發(fā)酵途徑（圖１－２），另一是以腸桿菌屬為代表的兼性厭氧菌的混合酸發(fā)酵途徑（圖逡逑１－３）。在丁酸發(fā)酵途徑中，可通過敲除基因阻斷丙酮酸生產(chǎn)乳酸的支路、敲除逡逑冰７基因阻斷生產(chǎn)甲酸的支路、敲除ａｃｔ聲ａ基因阻斷乙酰ＣｏＡ生成乙酸的支路、敲逡逑除似基因阻斷乙酰ＣｏＡ生成乙酰乙酰ＣｏＡ的支路、敲除五基因阻斷乙酰ＣｏＡ生逡逑產(chǎn)乙醇的支路、敲除吸氫酶基因或超量表達一些酶基因，在基因水平上實現(xiàn)產(chǎn)氫代謝逡逑途徑的調(diào)控，從而提高生物氫產(chǎn)量。Ｌｉ等（２０１０）敲除了嗜熱厭氧桿菌逡逑ＴＴｚｅ削似ｅ邋中的邋基因，使l#的產(chǎn)量提尚了邋２邋倍［１３２］。Ｌｉｕ逡逑等（２００６）通過基因敲除使酪丁酸梭菌中編碼ｉ酸激酶的ａｏｆｅ基因失活，使氫產(chǎn)量提逡逑高了邋１．５邋倍［１３３］。Ｓｏｏ邋等（２０１７）在邐ｃｏ／／邋ＳＳ１邋中分別同源表達／基因、逡逑異源表達梭菌辦必基因，氫產(chǎn)量相較野生型菌株分別提高了邋４１％、２０％［１３４］。Ｍｏｒｉｍｏｔｏ逡逑等（２００５）在梭菌Ｃ／ｏｒｆｒｚＷ／ｗｍ／ｗｍ／ｗｒｒｉ／ｆｃ灥Ｍ－２１中超量表達辦必基因，提高了氧逡逑產(chǎn)量
【學(xué)位授予單位】：北京化工大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：TQ116.2;TQ920.1

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 朱曉鵬;侯夢云;楊姣春;袁利和;許梅;張琴;;Klebsiella sp.分批發(fā)酵棉稈水解糖液產(chǎn)氫動力學(xué)研究[J];食品工業(yè);2017年09期

2 劉斌;JOST Günter;SCHMIEL Juliane;WOLF Arite;黃翔玲;谷力;王玉橋;葉德贊;;源于克雷伯氏菌Klebsiella sp. AC-11的3株噬菌體的生物學(xué)特性[J];海洋學(xué)報(中文版);2011年04期

3 彭月;朱能武;聶紅燕;;一株克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)Z6的分離及其產(chǎn)電特性研究[J];環(huán)境科學(xué)學(xué)報;2013年04期

相關(guān)會議論文 前3條

1 尹姣;瞿國勝;王行國;;klebsiella sp．601細菌漆酶基因的克隆[A];2006年度學(xué)術(shù)研討會論文摘要匯編[C];2006年

2 尹姣;瞿國勝;李洋;王行國;;Klebsiella sp．601細菌漆酶基因的克隆表達、蛋白純化與酶學(xué)性質(zhì)研究[A];湖北省暨武漢市生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)會第八屆第十七次學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2007年

3 李洋;尹嬌;王行國;;Klebsiella sp. 601細菌漆酶基因的克隆表達與酶學(xué)性質(zhì)的研究[A];“環(huán)境與健康”學(xué)術(shù)研討會論文摘要集[C];2007年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前2條

1 李艷賓;產(chǎn)氫細菌Klebsiella sp. WL1316的篩選及其發(fā)酵棉稈水解糖液合成生物氫的代謝調(diào)控[D];北京化工大學(xué);2018年

2 王圣惠;毒死蜱降解菌Klebsiella sp. CPK魔斑合成酶基因的鑒定及功能分析[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2010年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 姚甜甜;Klebsiella sp. GXK-1嗜鹽α-淀粉酶的酶學(xué)特性及定點突變研究[D];廣西大學(xué);2018年

2 唐曉e

本文編號：2589244