本文關(guān)鍵詞：G蛋白偶聯(lián)受體GPR17同源二聚作用的研究

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【摘要】：G蛋白偶聯(lián)受體(G Protein-Coupled Receptor, GPCR)是一大類與G蛋白偶聯(lián)的膜蛋白受體的統(tǒng)稱。它們均包含有7個(gè)跨膜a螺旋,在它們的C-端和連接第5和第6個(gè)跨膜螺旋的胞內(nèi)loop上都有與G蛋白結(jié)合的位點(diǎn)。GPCRs與細(xì)胞周圍環(huán)境中的相應(yīng)配體結(jié)合,可通過多種途徑激活細(xì)胞內(nèi)的一系列信號通路,最終參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能。GPCRs與許多疾病密切相關(guān),尤為重要的是,目前大約40%的臨床藥物都以GPCRs作為靶點(diǎn)。然而,我們對GPCRs的了解還極為缺乏,尤其是關(guān)于GPCRs的結(jié)構(gòu)、構(gòu)象變化、以及非G蛋白偶聯(lián)的作用機(jī)制,尚處于研究的起始階段,對這些作用的研究可促進(jìn)我們對GPCRs的了解。GPCRs的作用機(jī)制包括：(1)激活相應(yīng)的G蛋白,激活一系列信號通路,這是GPCRs經(jīng)典的信號通路；(2)通過受體內(nèi)化,受體內(nèi)化的機(jī)制和生物學(xué)意義由于研究方法相對成熟,近年來已經(jīng)獲得了許多進(jìn)展和認(rèn)識；(3)通過受體之間的同源或者異源二聚化,由于研究手段較為缺乏,雖然有一定的報(bào)道,研究者初步證明GPCRs能夠形成同源或異源二聚體,還解析了一部分二聚體的結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)二聚體形成能夠改變受體的功能,但對二聚體形成的機(jī)制和生物學(xué)意義還知之甚少。甚至還有人認(rèn)為GPCRs不會發(fā)生二聚化,所謂的二聚化只是研究過程中,由于現(xiàn)有研究手段都需要在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染相應(yīng)的受體,導(dǎo)致受體在細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)所產(chǎn)生的“假象”。研究GPCRs二聚化的主要技術(shù)包括生化技術(shù)(如免疫共沉淀、化學(xué)交聯(lián)結(jié)合免疫印跡法等),熒光分析技術(shù)(如單分子熒光、熒光共振能量轉(zhuǎn)移、熒光壽命成像-熒光共振能量轉(zhuǎn)移等),以及X射線晶體衍射技術(shù)等。其中,熒光壽命成像-熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy-Fluorescence Resonance Energy Transfer, FLIM-FRET)是一種基于供體的熒光壽命變化,來研究蛋白質(zhì)相互作用的新型熒光成像技術(shù)。相比于傳統(tǒng)FRET技術(shù),FLIM-FRET不受激發(fā)光強(qiáng)度、熒光團(tuán)濃度、光漂白、供體與受體激發(fā)光譜重疊等因素的影響,因此在GPCRs二聚化的研究中有著較大的優(yōu)勢。G蛋白偶聯(lián)受體17(GPR17)是一種P2Y樣受體,主要分布在腦內(nèi)、腎臟、心臟和血管內(nèi)皮等易受缺血再灌注損傷的器官。GPR17參與許多生理病理過程,如腦損傷、脊髓損傷、少突膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育及成熟,因此它具有成為相關(guān)疾病治療靶點(diǎn)的巨大潛能。近年來,人們開展了一系列對GPR17受體的研究。其中,關(guān)于GPR17的結(jié)構(gòu),GPR17是否存在同源或異源二聚體,尚不清楚。因此,本論文擬采用FLIM-FRET技術(shù)研究GPR17是否存在同源二聚體,并解析其同源二聚體的構(gòu)象。本論文首先在HEK 293T細(xì)胞,采用綠色熒光蛋宀(Green Fluorescent Protein, GFP)和紅色熒光蛋白(mCherry)作為FRET的熒光供體和受體,mCherry采用融合表達(dá)技術(shù),以基因工程的方法插入到GPR17的N-端或者細(xì)胞內(nèi)第三個(gè)bop(E255后),通過同樣的策略可以把GFP融合到GPR17的N-端或者細(xì)胞內(nèi)第三個(gè)bop(E255后)。此外,采用實(shí)驗(yàn)室近期發(fā)展的‘切割"GFP標(biāo)記策略,增加了三個(gè)GFP的標(biāo)記位點(diǎn),最后成功獲得五組可以用于FRET檢測的熒光供體和受體對(Donor-Acceptor pair);通過細(xì)胞內(nèi)鈣成像實(shí)驗(yàn),我們研究了熒光蛋白標(biāo)記對GPR17功能的影響；采用FLIM-FRET技術(shù),我們測量了五對熒光供體和受體之間的FRET效率,并且計(jì)算了各熒光供體和受體之間的距離；在二聚化構(gòu)象計(jì)算時(shí),我們首先采用同源建模,結(jié)合I-TASSER軟件,構(gòu)建了GPR17單體的結(jié)構(gòu)；然后結(jié)合五組熒光供體和受體對之間的距離,構(gòu)建了GPR17同源二聚體的結(jié)構(gòu)；基于GPR17的氨基酸序列,在PDB數(shù)據(jù)庫中,我們找到了與GPR17同源性最好的64個(gè)GPCRs的同源二聚體的結(jié)構(gòu),通過比對,我們發(fā)現(xiàn)其中12個(gè)GPCRs的二聚體結(jié)構(gòu)與我們預(yù)測的GPR17同源二聚體結(jié)構(gòu)具有相似的作用界面。在后續(xù)的研究中,我們將通過突變GPR17二聚化界面的氨基酸,來促進(jìn)／抑制GPR17的同源二聚化,進(jìn)一步闡明GPR17二聚化的生物學(xué)意義。就熒光標(biāo)記方法學(xué)而言,本論文除了發(fā)展了一種在細(xì)胞水平上對GPR17進(jìn)行多位點(diǎn)熒光標(biāo)記的方法外,還發(fā)展了另外兩種蛋白質(zhì)定點(diǎn)熒光標(biāo)記的方法——基于鑭系金屬結(jié)合有機(jī)配體的熒光探針(tpy-Tb3+;和tpy-Eu3+)和基于疏水性相互作用的羅丹明101內(nèi)鹽(Rhodamine 101 inner salt, Rh101)染料探針。其中,tpy-Tb3+:和tpy-Eu3+的特點(diǎn)在于：stoke位移大,能有效避免探針的自淬滅和激發(fā)波長對熒光檢測狹縫的散射光干擾,熒光壽命長,探針立體位阻小等。Rh101的特點(diǎn)在于：量子產(chǎn)率高,與蛋白質(zhì)結(jié)合強(qiáng)度大(納摩爾級別),光譜位于長波長區(qū)域,適用于活體檢測。綜上所述,本論文基于不同的熒光蛋白定點(diǎn)標(biāo)記策略,采用FLIM-FRET技術(shù),發(fā)現(xiàn)GPR17能夠形成同源二聚體,并結(jié)合計(jì)算和模擬獲得了其同源二聚體的模型。此外,本論文發(fā)展了蛋白質(zhì)定點(diǎn)熒光標(biāo)記的方法,在后續(xù)的研究過程中,它們將用于解答更多的生物學(xué)問題。
【關(guān)鍵詞】：G蛋白偶聯(lián)受體17 熒光蛋白 二聚化 熒光壽命成像-熒光共振能量轉(zhuǎn)移 鑭系金屬 羅丹明
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)院研究生院(武漢物理與數(shù)學(xué)研究所)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：O657.3
【目錄】：

• 致謝4-6
• 摘要6-9
• ABSTRACT9-15
• 1 引言15-27
• 1.1 G蛋白偶聯(lián)受體及研究的科學(xué)意義15
• 1.2 G蛋白偶聯(lián)受體二聚化的研究概況15-19
• 1.2.1 G蛋白偶聯(lián)受體二聚化的研究現(xiàn)狀15-16
• 1.2.2 研究GPCRs二聚化的常用方法介紹16-19
• 1.3 GPCRs單體同源建模的簡介19-20
• 1.4 蛋白質(zhì)定點(diǎn)熒光標(biāo)記技術(shù)的介紹20-23
• 1.4.1 小分子熒光探針的標(biāo)記20-21
• 1.4.2 熒光蛋白質(zhì)的標(biāo)記21-23
• 1.5 熒光光譜技術(shù)介紹23-27
• 1.5.1 熒光的基本原理23-24
• 1.5.2 熒光的基本特征24-25
• 1.5.3 FLIM-FRET技術(shù)的介紹25-27
• 2 細(xì)胞水平GPR17的多位點(diǎn)熒光蛋白標(biāo)記27-49
• 2.1 引言27-28
• 2.2 材料和方法28-39
• 2.2.1 蛋白質(zhì)氨基酸序列28-32
• 2.2.2 藥物和試劑32
• 2.2.3 實(shí)驗(yàn)儀器32-33
• 2.2.4 溶液配制33-34
• 2.2.5 實(shí)驗(yàn)方法34-39
• 2.3 結(jié)果與討論39-47
• 2.3.1 熒光蛋白的熒光光譜掃描39
• 2.3.2 細(xì)胞水平上GPR17的熒光標(biāo)記39-45
• 2.3.3 GFP標(biāo)記對GPR17功能的影響45-47
• 2.4 結(jié)論47-49
• 3 基于FLIM-FRET技術(shù)檢測GPR17的同源二聚化49-71
• 3.1 引言49-50
• 3.2 材料和方法50-61
• 3.2.1 蛋白質(zhì)氨基酸序列50-54
• 3.2.2 藥物和試劑54-55
• 3.2.3 實(shí)驗(yàn)儀器55
• 3.2.4 溶液配制55-56
• 3.2.5 實(shí)驗(yàn)方法56-61
• 3.3 結(jié)果與討論61-70
• 3.3.1 GPR17/G128：GFP10-11+GFP1-9體系中供體的壽命統(tǒng)計(jì)61-62
• 3.3.2 GPR17/R214：GFP10-11+GFP1-9體系中供體的壽命統(tǒng)計(jì)62-63
• 3.3.3 GPR17/R291：GFP10-11+GFP1-9體系中供體的壽命統(tǒng)計(jì)63-64
• 3.3.4 GPR17/N：GFP體系中供體的壽命統(tǒng)計(jì)64-65
• 3.3.5 GPR17/E255：GFP體系中供體的壽命統(tǒng)計(jì)65-66
• 3.3.6 GPR17分子間FRET效率與距離的計(jì)算66-67
• 3.3.7 GPR17單體結(jié)構(gòu)的同源建模與分子模擬67-68
• 3.3.8 GPR17同源二聚體模型的搭建68-69
• 3.3.9 GPR17同源二聚體結(jié)構(gòu)在PDB數(shù)據(jù)庫中的比對69-70
• 3.4 結(jié)論70-71
• 4 基于鑭系金屬絡(luò)合物的熒光探針的研究71-81
• 4.1 引言71-73
• 4.2 材料和方法73-75
• 4.2.1 樣品制備73-74
• 4.2.2 熒光光譜掃描實(shí)驗(yàn)74
• 4.2.3 熒光滴定實(shí)驗(yàn)74-75
• 4.3 結(jié)果與討論75-79
• 4.3.1 tpy-Tb~(3+)和tpy-Eu~(3+)的熒光光譜掃描75-76
• 4.3.2 tpy-Tb~(3+)與Ub的結(jié)合76-77
• 4.3.3 tpy-Eu~(3+)與Ub的結(jié)合77-79
• 4.4 結(jié)論79-81
• 5 基于疏水性相互作用的Rh101探針研究81-91
• 5.1 引言81-82
• 5.2 材料和方法82-85
• 5.2.1 樣品制備82-84
• 5.2.2 Rh101的熒光光譜掃描實(shí)驗(yàn)84
• 5.2.3 熒光滴定實(shí)驗(yàn)84-85
• 5.3 結(jié)果與討論85-88
• 5.3.1 Rh101的熒光光譜掃描85-86
• 5.3.2 WT Ub和Rh101的結(jié)合86-87
• 5.3.3 Ub/L8：tag與Rh10結(jié)合87-88
• 5.3.4 Ub/L8：tag和WT Ub與Rh101結(jié)合情況的比較88
• 5.4 結(jié)論88-91
• 6 總結(jié)與展望91-95
• 6.1 GPR17在細(xì)胞水平上的多位點(diǎn)熒光標(biāo)記91
• 6.2 GPR17在細(xì)胞水平上存在同源二聚化現(xiàn)象91-92
• 6.3 GPR17同源二聚體結(jié)構(gòu)的預(yù)測92
• 6.4 用于蛋白質(zhì)定點(diǎn)標(biāo)記的熒光探針研究92-93
• 6.5 展望93-95
• 參考文獻(xiàn)95-101
• 附錄A 熒光光譜檢測101-103
• 附錄B 激光共聚焦熒光顯微鏡的拍攝103-105
• 附錄C 熒光壽命成像(FLIM)拍攝105-109
• 附錄D 用于磁共振研究的賴氨酸甲基化修飾方法109-112
• 作者簡介及在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與研究成果112

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