本文關(guān)鍵詞：分子改造提高酸性α-淀粉酶熱穩(wěn)定性

  更多相關(guān)文章： 酸性α-淀粉酶 熱穩(wěn)定性 定點突變 分泌表達 純化 酶學性質(zhì)

【摘要】：本文主要目的是通過分子改造提高深海嗜熱菌Geobacillus sp.4j來源的酸性a-淀粉酶Gs4j-AmyA的熱穩(wěn)定性�；谇叭藢LA (Bacillus lecheniformis α-淀粉酶)和BStA (Bacillus stearothermophilus α-淀粉酶)的熱穩(wěn)定性位點的研究,選出11個氨基酸位點進行突變,并在大腸桿菌中進行了分泌表達。根據(jù)實驗結(jié)果,初步篩選出四個熱穩(wěn)定性提高的突變α-淀粉酶RGI179-181Q、IG181-182* C363G、N463T,并進行IG181-182*/C363G和IG181-182*/N463T組合突變。通過優(yōu)化純化條件,最終通過超濾和鎳柱純化的方法得到電泳純的原始酶和突變酶。為了探究突變酶的熱穩(wěn)定性,分別測定了原始酶和突變酶在70℃、85℃、95℃C溫度下的半衰期。突變酶RGl179-181Q和IG181-182*在70℃下的半衰期分別是原始淀粉酶的59倍和63倍,熱穩(wěn)定性得到極大的提高。單突變酶C363G和N463T的半衰期與原始淀粉酶相比基本沒有提升,C363G僅在70℃時半衰期較原始淀粉酶提高了21%,而N463T在85℃和95℃時的半衰期分別下降了6.2%和34%。然而,組合突變IG181-182*/C363G和IG181-182*/N463T在70℃的半衰期分別在IG181-182*突變酶的基礎(chǔ)上提高了17%和39%。突變酶和原始淀粉酶的最適溫度(65～70℃)和最適pH(5.5～5.6)基本相同。與原始淀粉酶相比,四個突變酶C363G, N463T, IG181-182*/C363G和IG181-182*/N463T的催化效率分別下降了59%、50%、37%、16%。但突變酶RGl179-181Q和IG181-182*的催化效率和原始淀粉酶基本相同,為40×105min-1左右。通過對同源建模得到的分子結(jié)構(gòu)模型分析發(fā)現(xiàn),IG181-182兩個氨基酸的缺失突變使得Ca2+結(jié)合網(wǎng)絡(luò)增強,這可能是IG181-182*突變酶熱穩(wěn)定性增強的重要原因。N463T突變使得該位點的氫鍵數(shù)量減少(5變成了3),這可能是單突變酶N463T熱穩(wěn)定性下降的主要原因。
【關(guān)鍵詞】：酸性α-淀粉酶 熱穩(wěn)定性 定點突變 分泌表達 純化 酶學性質(zhì)
【學位授予單位】：華東理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：O629.8
【目錄】：

• 摘要5-6
• abstract6-11
• 第1章 文獻綜述11-26
• 1.1 淀粉酶11-16
• 1.1.1 淀粉酶的分類11
• 1.1.2 酸性α-淀粉酶的工業(yè)應用11-14
• 1.1.3 酸性α-淀粉酶結(jié)構(gòu)及保守域14-16
• 1.2 酸性α-淀粉酶的耐熱性16-19
• 1.2.1 酸性α-淀粉酶的耐熱機理16-17
• 1.2.2 淀粉酶熱穩(wěn)定性相關(guān)位點17-19
• 1.3 酶的定向改造方法19-21
• 1.3.1 酶的非理性設(shè)計19-20
• 1.3.2 酶的理性設(shè)計20-21
• 1.4 基因定點突變技術(shù)原理與方法21-24
• 1.4.1 寡核苷酸定向誘變22-23
• 1.4.2 盒式誘變23
• 1.4.3 重疊延伸PCR23
• 1.4.4 全質(zhì)粒擴增誘變23-24
• 1.5 本課題研究目的及意義24-26
• 第2章 熱穩(wěn)定性提高的酸性α-淀粉酶的初步篩選26-38
• 2.1 前言26
• 2.2 實驗材料和方法26-31
• 2.2.1 菌株、質(zhì)粒和試劑26-27
• 2.2.2 確定熱穩(wěn)定性相關(guān)位點的方法27
• 2.2.3 大腸桿菌感受態(tài)制備27-28
• 2.2.4 大腸桿菌轉(zhuǎn)化28
• 2.2.5 突變α-淀粉酶基因28-30
• 2.2.6 突變酶在大腸桿菌中誘導表達30
• 2.2.7 DNS試劑測還原糖含量標準曲線30-31
• 2.2.8 α-淀粉酶的酶活力測定31
• 2.2.9 初篩熱穩(wěn)定性提高的α-淀粉酶31
• 2.3 結(jié)果與討論31-37
• 2.3.1 確定熱穩(wěn)定性相關(guān)位點31-34
• 2.3.2 突變α-淀粉酶基因34-36
• 2.3.3 初篩熱穩(wěn)定性提高的突變α-淀粉酶36-37
• 2.4 本章小結(jié)37-38
• 第3章 熱穩(wěn)定性提高的突變酶的純化及酶學性質(zhì)38-54
• 3.1 前言38
• 3.2 實驗材料38-39
• 3.3 實驗方法39-42
• 3.3.1 突變酶在大腸桿菌中誘導表達39
• 3.3.2 淀粉酶蛋白純化39-40
• 3.3.3 蛋白SDS-PAGE方法40
• 3.3.4 Bradford法測蛋白濃度40-41
• 3.3.6 α-淀粉酶的酶動力學參數(shù)測定41
• 3.3.7 淀粉酶半衰期測定方法41-42
• 3.3.8 最適溫度和最適pH測定42
• 3.4 結(jié)果和討論42-53
• 3.4.1 原始酶純化條件優(yōu)化42-44
• 3.4.2 突變酶的蛋白純化44-47
• 3.4.3 純化倍數(shù)和回收率計算47-49
• 3.4.4 不同溫度下的半衰期49-51
• 3.4.5 最適溫度和最適pH值51
• 3.4.6 酶動力學參數(shù)51-53
• 3.5 本章小結(jié)53-54
• 第4章 同源建模和熱穩(wěn)定性相關(guān)位點分析54-59
• 4.1 前言54
• 4.2 實驗方法54
• 4.3 結(jié)果與討論54-58
• 4.3.1 同源建模得三維結(jié)構(gòu)模型54-55
• 4.3.2 IG181-182~*突變位點分析55-56
• 4.3.3 C363G和N463T突變位點分析56-57
• 4.3.4 催化效率下降的原因分析57-58
• 4.4 本章小結(jié)58-59
• 第5章 總結(jié)與展望59-61
• 5.1 全文總結(jié)59-60
• 5.2 創(chuàng)新點60
• 5.3 展望60-61
• 參考文獻61-66
• 論文發(fā)表66-67
• 致謝67

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