本文關(guān)鍵詞：介孔碳納米粒的表面修飾及其生物相容性研究

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【摘要】：在生物醫(yī)藥領(lǐng)域眾多具有應(yīng)用前景的納米材料中,碳基納米材料占據(jù)著重要的地位,如碳納米管、石墨烯和介孔碳材料等,其中介孔碳納米材料是一類新型具有較大應(yīng)用潛能的多孔碳納米材料。它具有大的比表面積和孔容,能提供高的載藥能力；具有可調(diào)的孔徑結(jié)構(gòu)和孔隙,可以控制內(nèi)裝藥物分子的釋放,在藥物傳送系統(tǒng)領(lǐng)域有較好的應(yīng)用前景,然而在用于臨床之前,必須充分了解納米材料的物理化學(xué)性質(zhì)和不良的生理反應(yīng),仔細(xì)的評估毒性和生物相容性。前期研究中本課題組成功制備了PEG修飾的氧化介孔碳納米粒作為抗腫瘤藥物阿霉素(DOX)的載體,該納米粒具有良好的親水性和很高的載藥量,DOX的釋放具有pH響應(yīng)性,同時在體內(nèi)外具有良好的抗腫瘤活性。其他已有的研究也表明,在碳納米材料表面修飾或嫁接某些親水性分子如聚乙二醇(PEG)或聚乙烯吡咯烷酮(PVP),可改善碳納米材料的分散性和血液穩(wěn)定性,顯著提高載體吸附藥物的能力和在循環(huán)系統(tǒng)半衰期,避免網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的捕獲以防止藥物在傳遞過程中的非特異性釋放,從而提高碳納米材料的生物相容性。因此本課題擬在前期工作基礎(chǔ)上,用聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-甲氧基聚乙二醇2000(DSPE-mPEG2000)對介孔碳納米粒進(jìn)行表面修飾,從細(xì)胞水平、免疫系統(tǒng)作用和整體動物水平研究修飾前后介孔碳納米粒的生物相容性,為介孔碳材料未來在臨床醫(yī)藥領(lǐng)域的可能應(yīng)用提供一定的依據(jù)。第一章主要介紹了介孔碳納米粒的合成、表面修飾及相關(guān)表征。我們通過低濃度水熱合成法成功制備了介孔碳納米粒,透射電鏡等檢測表明介孔碳納米粒為較規(guī)則的球形,粒徑均一,約為90nm,同時具有良好的有序介觀結(jié)構(gòu)。主要依靠介孔碳納米粒強(qiáng)吸附作用在其表面進(jìn)行修飾,并通過透射電鏡、傅立葉紅外光譜、熱重分析、核磁、紫外-可見分光光度計和馬爾文粒徑儀等對修飾前后的介孔碳納米粒進(jìn)行了較系統(tǒng)的表征,表明PVP和DSPE-mPEG2000成功的修飾到介孔碳納米粒的表面,并提高了其在水溶液中的分散性和穩(wěn)定性。細(xì)胞攝取實驗結(jié)果表明,介孔碳納米�？梢栽谳^短時間內(nèi)(2h)被正常細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞攝取。第二章主要是測定了修飾前后介孔碳納米粒的細(xì)胞毒性和對細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平的影響。通過CCK-8實驗、細(xì)胞凋亡實驗、活性氧檢測等方法測定表明,在低于100μg/ml濃度范圍內(nèi),MCN、MCN-PVP和MCN-PEG與L929細(xì)胞共孵育24h時,MCN表現(xiàn)出輕微的細(xì)胞毒性,而PVP和DSPE-mPEG2000對MCN的表面修飾能降低其對L929細(xì)胞的毒性；而48h時,不同濃度的MCN細(xì)胞存活率有所提高,說明MCN本身對L929細(xì)胞的毒性較低。修飾和未修飾的介孔碳納米粒與HeLa細(xì)胞共孵育24h或48h后,均未觀察到細(xì)胞毒性作用,說明介孔碳納米粒是相對安全的。細(xì)胞凋亡實驗結(jié)果也表明,修飾和未修飾的介孔碳納米粒不會誘導(dǎo)L929和HeLa細(xì)胞發(fā)生凋亡。細(xì)胞內(nèi)ROS水平測定表明,MCN可顯著誘導(dǎo)L929和HeLa細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生,產(chǎn)生ROS量隨著納米粒濃度的增加而增多,但修飾后的介孔碳納米粒相比未修飾前可顯著降低刺激細(xì)胞產(chǎn)生ROS的量,降低細(xì)胞氧化應(yīng)激水平和介孔碳納米粒對細(xì)胞的刺激性。第三章我們完成了介孔碳納米粒的初步免疫毒性評價。100μg/ml的MCN. MCN-PVP和MCN-PEG刺激能夠mDCs表面分子CDllc.I-Ab、CD40表達(dá)量升高,促進(jìn)mDCs表型成熟。濃度為100μ/ml時,PVP和DSPE-mPEG2000修飾后介孔碳納米粒能顯著的降低未修飾介孔碳納米粒刺激小鼠樹突狀細(xì)胞分泌的炎癥細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的水平。在25～100μg/ml濃度范圍內(nèi),MCN.MCN-PVP和MCN-PEG能誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞的凋亡,并且隨著納米粒濃度的增大T淋巴細(xì)胞凋亡的越多。高濃度時,對T淋巴細(xì)胞有較高的免疫毒性,PVP和DSPE-mPEG2000修飾后沒有明顯的降低T淋巴細(xì)胞的凋亡率。通過生物透射電子顯微鏡的觀察到介孔碳納米粒通過細(xì)胞的內(nèi)吞進(jìn)入到RAW264.7細(xì)胞,并在細(xì)胞質(zhì)中聚集,作為藥物載體可以攜帶藥物穿過細(xì)胞膜。修飾和未修飾的介孔碳納米粒對RAW264.7細(xì)胞毒性小,可能由于小鼠巨噬細(xì)胞較強(qiáng)的吞噬和降解處理能力有關(guān)。第四章介孔碳納米粒的生物毒性效應(yīng)初步研究。MCN.MCN-PVP和MCN-PEG濃度在0～100μg/ml范圍內(nèi)均無溶血現(xiàn)象(HR%5%),說明介孔碳納米粒具有良好的血液相容性。連續(xù)7天尾靜脈注射劑量為0.2m1/10g、濃度為1mg/ml的MCN.MCN-PVP和MCN-PEG后,各器官的組織切片說明納米粒不會引起小鼠的組織纖維化、變性和壞死等病理性改變。但是在肺組織切片中可以觀察到聚齊的介孔碳納米粒,可能是由于其在體內(nèi)的血流動力學(xué)影響,PVP或DSPE-mP EG2000修飾后的介孔碳納米�？梢詼p少在肺的殘留量,因為介孔碳納米粒容易在血管壁沉積,而修飾后的納米粒分散性提高,提高M(jìn)CN-PVP和MCN-PEG在血管中的流動性。介孔碳納米粒不影響小鼠的肝腎功能,也沒有激活小鼠的補(bǔ)體C3。以上結(jié)果表明,本課題成功制備了介孔碳納米粒,并成功的將生物相容性的高分子PVP和PEG修飾到介孔碳納米粒的表面。從細(xì)胞水平實驗可以得到介孔碳納米粒本身具有較好的生物相容性,但是對細(xì)胞具有一定的刺激性,修飾后介孔碳納米�？梢蕴岣咂渖锇踩浴＝榭滋技{米粒對T淋巴細(xì)胞毒性有著劑量依賴性,修飾后沒有降低其對T淋巴細(xì)胞的毒性。從動物水平實驗可以得到修飾前后的介孔碳納米粒具有良好的生物相容性。本研究為介孔碳納米粒在臨床醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用提供一定的毒理學(xué)理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：介孔碳 表面修飾 聚乙烯吡咯烷酮(PVP) 二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-甲氧基聚乙二醇2000(DSPE-mPEG2000) 生物相容性
【學(xué)位授予單位】：福建中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R943;O613.71
【目錄】：

• 中文摘要7-10
• Abstract10-14
• 前言14-16
• 第一章 介孔碳納米粒的合成、修飾及表征16-28
• 1. 實驗材料16-17
• 1.1 主要儀器設(shè)備16-17
• 1.2 主要材料和試劑17
• 2. 實驗方法17-19
• 2.1 介孔碳納米粒(MCN)的合成17-18
• 2.2 介孔碳納米粒的表面修飾18
• 2.3 材料的表征18
• 2.4 分散性評估18
• 2.5 介孔碳納米粒負(fù)載異硫氰酸熒光素(MCN-FITC)的合成18-19
• 2.6 流式細(xì)胞儀檢測MCN被L929細(xì)胞的吞噬19
• 2.7 熒光顯微鏡觀察HeLa細(xì)胞對MCN的攝取19
• 3. 結(jié)果與討論19-27
• 3.1 MCN的合成和表征19-21
• 3.2 MCN的表面修飾及表征21-24
• 3.3 PVP和DSPEG-mPEG2000修飾對MCN的分散性的影響24-25
• 3.4 流式細(xì)胞儀檢測MCN被L929細(xì)胞的吞噬25-26
• 3.5 熒光顯微鏡觀察HeLe細(xì)胞對MCN的攝取26-27
• 4. 本章小結(jié)27-28
• 第二章 介孔碳納米粒的細(xì)胞毒性研究28-35
• 1. 實驗材料28
• 1.1 主要儀器設(shè)備28
• 1.2 主要材料和試劑28
• 2. 實驗方法28-30
• 2.1 細(xì)胞培養(yǎng)28-29
• 2.2 C-8法考察納米粒的細(xì)胞毒性29
• 2.3 細(xì)胞凋亡實驗29
• 2.4 細(xì)胞ROS水平的測定29-30
• 3. 結(jié)果與討論30-34
• 3.1 CCK-8細(xì)胞毒性實驗結(jié)果30-31
• 3.2 細(xì)胞凋亡實驗結(jié)果31-33
• 3.3 ROS水平的測定結(jié)果33-34
• 4. 本章小結(jié)34-35
• 第三章 介孔碳納米粒的免疫毒性評價35-45
• 1. 實驗材料35-36
• 1.1 主要儀器設(shè)備35
• 1.2 主要材料和試劑35-36
• 2. 實驗方法36-38
• 2.1 小鼠樹突狀細(xì)胞(mDCs)的培養(yǎng)36
• 2.2 MCN、MCN-PVP、MCN-PEG對mDCs表面分子表達(dá)的影響36
• 2.3 納米粒刺激mDCs分泌細(xì)胞因子的測定36-37
• 2.4 T淋巴細(xì)胞凋亡的測定37
• 2.5 RAW264.7細(xì)胞對MCN的攝取37
• 2.6 RAW264.7細(xì)胞的CCK-8實驗37-38
• 3. 結(jié)果與討論38-43
• 3.1 納米粒對mDCs表面分子表達(dá)的影響38-40
• 3.2 納米粒刺激mDCs分泌細(xì)胞因子的檢測40
• 3.3 T淋巴細(xì)胞凋亡實驗40-41
• 3.4 生物透射電子顯微鏡觀察RAW264.7對MCN的攝取41-42
• 3.5 CCK-8法評價納米粒對RAW264.7的細(xì)胞毒性42-43
• 4. 本章小結(jié)43-45
• 第四章 介孔碳納米粒的生物毒性效應(yīng)初步研究45-51
• 1. 實驗材料45
• 1.1 主要儀器設(shè)備45
• 1.2 主要材料和試劑45
• 2. 實驗方法45-47
• 2.1 體外溶血實驗45-46
• 2.2 小鼠體內(nèi)組織病理學(xué)分析46
• 2.3 小鼠血液生化指標(biāo)檢測46-47
• 2.4 小鼠補(bǔ)體C3的檢測47
• 3. 結(jié)果與討論47-50
• 3.1 溶血實驗檢測納米粒的血液相容性47-48
• 3.2 血液生化指標(biāo)檢測結(jié)果48-49
• 3.3 小鼠血清補(bǔ)體C3的變化49-50
• 4. 本章小結(jié)50-51
• 結(jié)論51-53
• 參考文獻(xiàn)53-56
• 致謝56-57
• 文獻(xiàn)綜述57-62
• 參考文獻(xiàn)60-62
• 作者簡歷62

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本文編號：937177