本文關(guān)鍵詞：基于納米熒光探針的細(xì)菌芯片高效分析方法研究

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【摘要】：面對國內(nèi)外出現(xiàn)的多起嚴(yán)重威脅社會公共安全的食品和水源中致病菌中毒事件,以及現(xiàn)有致病菌檢測技術(shù)存在的檢測耗時長、檢測設(shè)備龐大、操作繁雜等不足,本研究將微流控芯片技術(shù)和納米技術(shù)結(jié)合,提出了高熒光強度、低背景干擾和高選擇性納米熒光探針標(biāo)記的細(xì)菌熒光檢測法和用于細(xì)菌高特異性、高靈敏、快速準(zhǔn)確定量檢測的細(xì)菌微流控芯片原位熒光檢測法,為食品和水源中背景復(fù)雜、低含量的細(xì)菌(致病菌)的快速準(zhǔn)確檢測提供了新方法,對食品安全和環(huán)境衛(wèi)生的評價具有重要研究價值和應(yīng)用前景。本文的主要研究工作及結(jié)果如下:(1)吖啶橙熒光標(biāo)記的細(xì)菌微流控芯片檢測研究設(shè)計并制作了集成7通道PDMS-Glass微流控芯片,并以大腸桿菌JM109為模板菌種,采用熒光量子產(chǎn)率高達(dá)0.92的吖啶橙標(biāo)記,采用熒光光譜儀及微流控芯片微型熒光檢測儀檢測,大腸桿菌JM109分別在10~2-10~6 cfu·mL~(-1)和103-105cfu·mL~-濃度范圍內(nèi)存在良好的線性關(guān)系。最后,以超市凍豬肉為實際樣本,對其國標(biāo)法預(yù)處理后,同樣AO標(biāo)記通入自行設(shè)計的7通道PDMS-Glass微流控芯片熒光檢測和分析,多組測試結(jié)果顯示豬肉樣本表面含菌總數(shù)在103-104 cfu·mL~(-1)范圍內(nèi),這與國標(biāo)法-平板計數(shù)法測試結(jié)果基本一致,且檢測時間從國標(biāo)法的48 h縮短至不到4 h,極大的縮短了食源性致病菌檢測時間,為食品安全快速檢測提供了新思路,也為現(xiàn)場便攜式細(xì)菌快速檢測提供了新途徑。(2)自制殼層式AO@SiO_2-NH_2熒光納米探針定量檢測金黃色葡萄球菌以吖啶橙(AO)為熒光內(nèi)核材料,通過改進的反相微乳液法合成了呈規(guī)則球形大小均一,單分散性好,平均粒徑為80 nm左右,表面帶氨基且光穩(wěn)定性較好的核殼結(jié)構(gòu)AO@SiO_2-NH_2熒光納米粒子。進而以金黃色葡萄球菌為實驗樣本,通過戊二醛分步交聯(lián)將自制的AO@SiO_2-NH_2作為高效低毒熒光標(biāo)記探針對金黃葡萄球菌進行標(biāo)記并進行熒光檢測,金黃色葡萄球菌濃度對數(shù)與相應(yīng)的熒光信號強度在103-107 cfu·mL~(-1)的濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,線性回歸方程為:I FL=69.188log(c)-161.28,線性相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.9814,檢出限達(dá)到5×10~2 cfu·mL~(-1)。將該方法用于合成樣本中金黃葡萄球菌細(xì)菌進行檢測,回收率在96.5%-102.7%之間,RSD小于7%(n=5)。該方法具有簡單直接、條件溫和、檢測時間短、靈敏度高和線性范圍寬(跨越5個數(shù)量級)等優(yōu)點。(3)基于石墨烯-碳點FRET效應(yīng)和適配體特異性識別的鼠傷寒沙門氏菌微流控細(xì)菌芯片檢測利用石墨烯對適配體自動吸附及其熒光猝滅特性,提出特異性識別鼠傷寒沙門氏菌的納米熒光碳點-適配體(CDs-Apt)識別探針,設(shè)計制作了電沉積氧化石墨烯微流控陣列芯片,搭建了微流控芯片-LED誘導(dǎo)熒光原位檢測分析微系統(tǒng),針對鼠傷寒沙門氏菌建立了高靈敏性、高選擇性和高通量的細(xì)菌檢測模式和方法。實驗首先采用改良的Hummers法和水熱法分別制備得到水溶性的單層氧化石墨烯和納米熒光碳點;通過ITO導(dǎo)電玻璃上電沉積還原氧化石墨烯成功制備得到rGO/ITO微陣列芯片,并以芯片上沉淀的石墨烯為吸附基質(zhì)和納米淬滅劑,吸附識別探針CDs-Apt,構(gòu)建的基于形成FRET原理的高靈敏熒光信號增強型微流控芯片傳感平臺,在CDs-Apt濃度為1μM,流速為1.0μL·min-1,淬滅時間和恢復(fù)時間分別為10 min和30 min的條件下,2 h內(nèi)實現(xiàn)了鼠傷寒沙門氏菌的在線分析,且檢測范圍為10~2-10~6 cfu·mL~(-1),檢出限為100 cfu·mL~(-1)。通過檢驗CDs-Apt/GO復(fù)合物與大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的作用,證明該芯片傳感系統(tǒng)對于目標(biāo)菌具有高選擇性和高特異性,同時將該方法用于自來水等合成樣本中鼠傷寒沙門氏菌的檢測,回收率在96.5%-102.0%之間,RSD小于6%(n=7)。這種簡單、集成的高通量檢測芯片,可發(fā)展為復(fù)雜樣品的自動化、集成化分析檢測平臺,推廣到其它的生物分析體系中。
【關(guān)鍵詞】：新型納米熒光探針 微流控芯片 細(xì)菌檢測
【學(xué)位授予單位】：重慶大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：O657.3
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 1 緒論10-24
• 1.1 引言10
• 1.2 國內(nèi)外研究現(xiàn)狀及發(fā)展動態(tài)分析10-11
• 1.3 基于微流控芯片技術(shù)的食源性致病菌檢測研究進展11-13
• 1.3.1 微流控芯片技術(shù)11-12
• 1.3.2 微流控芯片細(xì)菌分析檢測技術(shù)12-13
• 1.4 細(xì)菌標(biāo)記和檢測的納米熒光探針13-15
• 1.5 基于納米熒光探針的微流控芯片細(xì)菌分析方法研究進展15-21
• 1.5.1 基于納米金標(biāo)記的微流控芯片細(xì)菌檢測應(yīng)用15-16
• 1.5.2 基于量子點（QDs）標(biāo)記的微流控芯片細(xì)菌檢測應(yīng)用16-18
• 1.5.3 基于碳納米材料標(biāo)記的微流控芯片細(xì)菌檢測應(yīng)用18-19
• 1.5.4 基于熒光二氧化硅納米探針標(biāo)記的微流控芯片細(xì)菌檢測應(yīng)用19-21
• 1.6 研究意義及主要研究內(nèi)容21-24
• 1.6.1 研究目的與意義21-22
• 1.6.2 研究工作的技術(shù)路線22
• 1.6.3 主要研究內(nèi)容22-24
• 2 吖啶橙熒光標(biāo)記的細(xì)菌微流控芯片檢測研究24-34
• 2.1 引言24-25
• 2.2 實驗部分25-27
• 2.2.1 儀器與設(shè)備25
• 2.2.2 溶液配制25-26
• 2.2.3 微流控細(xì)菌芯片制作26
• 2.2.4 吖啶橙（AO）標(biāo)記細(xì)菌芯片熒光檢測26
• 2.2.5 豬肉樣本分析26-27
• 2.3 結(jié)果與討論27-32
• 2.3.1 微流控細(xì)菌芯片設(shè)計27
• 2.3.2 微流控細(xì)菌芯片分析體系的構(gòu)建27-28
• 2.3.3 吖啶橙（AO）直接標(biāo)記大腸桿菌JM109的熒光光譜儀檢測結(jié)果28-29
• 2.3.4 吖啶橙（AO）標(biāo)記的大腸桿菌JM109的微流控芯片原位熒光檢測結(jié)果29-31
• 2.3.5 芯片熒光原位檢測法、熒光光譜儀檢測法與國標(biāo)平板計數(shù)法的對照分析31-32
• 2.4 本章小結(jié)32-34
• 3 自制殼層式AO@SIO_2-NH_2熒光納米探針定量檢測金黃色葡萄球菌34-48
• 3.1 引言34-35
• 3.2 實驗部分35-37
• 3.2.1 試劑與儀器35-36
• 3.2.2 溶液的配制36
• 3.2.3 AO@SiO_2-NH_2 NPs的合成36
• 3.2.4 AO@SiO_2 NH_2 NPs的表征36-37
• 3.2.5 AO@SiO_2 NH_2 NPs標(biāo)記金黃色葡萄球菌及定量分析37
• 3.2.6 金黃色葡萄球菌熒光定量檢測37
• 3.3 結(jié)果與討論37-46
• 3.3.1 AO@SiO_2 NH_2 NPs的設(shè)計原理37-38
• 3.3.2 AO@SiO_2 NH_2 NPs的表征結(jié)果38-42
• 3.3.3 AO@SiO_2 NH_2 NPs標(biāo)記金黃色葡萄球菌定量分析結(jié)果42-45
• 3.3.4 樣本分析45-46
• 3.4 本章小結(jié)46-48
• 4 基于氧化石墨烯-碳點FRET效應(yīng)的鼠傷寒沙門氏菌微流控芯片檢測研究48-66
• 4.1 引言48-49
• 4.2 實驗部分49-53
• 4.2.1 試劑與儀器49-50
• 4.2.2 溶液的配制50
• 4.2.3 熒光碳點（CDs）及氧化石墨烯的合成50-51
• 4.2.4 熒光碳點（CDs）及氧化石墨烯的表征51
• 4.2.5 熒光碳點-沙門氏菌適配體復(fù)合物的制備51-52
• 4.2.6 多通道PDMS-rGO/ITO細(xì)菌芯片的制備52-53
• 4.2.7 多通道PDMS-rGO/ITO細(xì)菌芯片上鼠傷寒沙門氏菌的標(biāo)記和在線檢測53
• 4.3 結(jié)果與討論53-64
• 4.3.1 熒光碳點（CDs）及氧化石墨烯的表征結(jié)果53-55
• 4.3.2 多通道PDMS-rGO/ITO芯片設(shè)計思路及其檢測沙門氏菌的原理55-56
• 4.3.3 多通道PDMS-rGO/ITO芯片的制作及測試系統(tǒng)搭建56-58
• 4.3.4 微流控芯片上實現(xiàn)鼠傷寒沙門氏菌的定量檢測和顯微觀測58-63
• 4.3.5 樣本分析63-64
• 4.4 本章小結(jié)64-66
• 5 結(jié)論與展望66-68
• 5.1 結(jié)論66-67
• 5.2 展望67-68
• 致謝68-70
• 參考文獻(xiàn)70-80
• 附錄80
• A. 作者在攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文目錄80
• B. 作者在攻讀碩士學(xué)位期間參加的科研項目80

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前6條

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中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 王一嫻;快速檢測農(nóng)產(chǎn)品中大腸桿菌O157：H7的生物傳感方法與儀器研究[D];浙江大學(xué);2013年

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本文編號：892297