本文關(guān)鍵詞：DNA自組裝納米結(jié)構(gòu)在生物傳感中的應(yīng)用

  更多相關(guān)文章： DNA自組裝 DNA納米結(jié)構(gòu) 信號放大 生物傳感

【摘要】：沃森(Watson)和克里克(Crick)在1953年發(fā)現(xiàn)了DNA堿基配對原則和雙螺旋結(jié)構(gòu),自此以后,分子生物學(xué)得到了飛速發(fā)展。由于DNA分子具有小巧堅固的結(jié)構(gòu),高信息量存儲和特異性的堿基配對特點,使得其可以作為分子建筑模塊來構(gòu)建功能化的納米材料和器件。上世紀八十年代,紐約大學(xué)的Nadrian C.Seeman教授開創(chuàng)了DNA納米自組裝技術(shù),該技術(shù)利用DNA分子作為組裝模塊材料,通過自下至上的方式,組裝出了許多有確定幾何結(jié)構(gòu)的納米級物體。隨后,在過去的三十年里,一系列可尋址的一維,二維以及三維的DNA納米結(jié)構(gòu)接連創(chuàng)造了出來,然而,發(fā)展具有功能性的確定幾何外形的DNA納米結(jié)構(gòu)卻是一個亟待解決的問題。現(xiàn)階段報道的DNA納米結(jié)構(gòu)僅處于模型階段,而它的生物應(yīng)用還處于萌芽階段,本論文基于DNA自組裝形成的新型納米結(jié)構(gòu)并運用于生物傳感,開發(fā)出了低成本、操作簡便以及高靈敏的新型納米生物傳感器。1.RNA調(diào)控的分子鉗子靈敏檢測癌細胞中microRNA基于DNA鉗子納米探針,本文構(gòu)建了一種免酶且高選擇性的生物傳感器用于前列腺癌細胞中microRNA(miR-141)的檢測。我們用非變性凝膠電泳表征了自組裝形成的DNA鉗子的調(diào)控能力。當(dāng)加入燃料鏈,即目標(biāo)物microRNA的時候,鉗子機器裝置迫使被關(guān)閉,導(dǎo)致熒光淬滅。當(dāng)加入抗燃料鏈時,目標(biāo)物被置換出來,并釋放出支架鏈,鉗子機器重新回到打開的狀態(tài)熒光恢復(fù)。體系中只要交替的加入目標(biāo)鏈和抗燃料鏈,該裝置就會循環(huán)往復(fù)的進行打開/關(guān)閉的操作。目標(biāo)物miR-141對DNA鉗子納米機器的調(diào)控能力與其濃度成線性關(guān)系,因此,能夠用于檢測miR-141,檢測限可低至0.6 pmol.L-1。體系中設(shè)計操作的DNA鉗子納米機器是基于toehold介導(dǎo)的鏈置換反應(yīng),具有很強的特異性,能夠在成分復(fù)雜的細胞裂解液中檢測出目標(biāo)物。2.MicroRNA誘導(dǎo)催化自組裝DNA納米結(jié)構(gòu)靈敏檢測癌細胞中microRNA通過聯(lián)合雜交鏈式反應(yīng)(HCR)和T-連接內(nèi)聚(T-junction cohesion)自組裝方式,我們成功的組裝出一個具有36±8 nm的DNA納米輪,組裝過程中設(shè)計的toehold介導(dǎo)的鏈置換反應(yīng),使得目標(biāo)物miR-141得以循環(huán)使用,從而實現(xiàn)了從腫瘤細胞中超靈敏的檢測miR-141,檢測限達到261個細胞。本體系中,避免了使用酶和制備復(fù)雜的納米材料,穩(wěn)定性得到了很大的提升,和傳統(tǒng)報道的基于DNA折紙自組裝方式不同的是,實驗過程中僅僅涉及到四條DNA鏈,避免了復(fù)雜且耗時的DNA鏈設(shè)計過程,同時也節(jié)約了實驗成本。DNA自組裝形成的納米輪具有高的選擇性,能夠?qū)崿F(xiàn)單堿基錯配檢測,因此能夠運用于不同的生物標(biāo)志物的檢測。3.末端保護的小分子鏈接的ssDNA用于游離且靈敏的比色法檢測葉酸受體小分子/蛋白之間的特異性作用在藥物研發(fā),醫(yī)學(xué)臨床診斷,生物蛋白代謝之間的相互作用起著至關(guān)重要的作用。利用葉酸(FA)和葉酸受體(FR)之間的特異性結(jié)合性質(zhì),此體系設(shè)計了一種便捷高效且靈敏的比色生物傳感器用于檢測生物標(biāo)志物,葉酸受體蛋白。傳感器的設(shè)計原理是依靠末端保護的FA連接的單鏈DNA(ssDNA)引發(fā)自組裝形成的DNAzyme聚合物進行信號放大檢測。目標(biāo)蛋白FR通過特異性結(jié)合作用與連接在ssDNA上的FA結(jié)合,結(jié)合FR的FA-ssDNA探針能抵制Exo I的水解。受到保護的單鏈DNA能引發(fā)兩個包含G四倍體序列的發(fā)夾DNA自組裝形成DNAzyme聚合物,從而使得溶液的顏色發(fā)生顯著的變化達到免標(biāo)記且靈敏的比色檢測FR的目的。通過聚丙烯凝膠電泳我們證明了末端保護的ssDNA觸發(fā)自組裝形成的DNAzyme聚合物,對實驗參數(shù)也進行了優(yōu)化。在最優(yōu)實驗條件下,能用紫外吸收光譜儀檢測到0.35 pmol.L-1的FR,而能用肉眼直接檢測到5 pmol.L-1的FR。研發(fā)的傳感器具有很高的選擇性能在干擾物質(zhì)中特異性識別出目標(biāo)物,并能在血清樣品中檢測目標(biāo)物,這使得設(shè)計的末端保護自組裝傳感器能用于檢測不同類型的小分子/蛋白之間的相互作用。4.基于未修飾的適體和DNAzyme用以目標(biāo)循環(huán)放大檢測ATP基于目標(biāo)循環(huán)放大的方法,我們利用未修飾的適體和DNAzyme構(gòu)建了一種免標(biāo)記的,簡單靈敏的比色ATP檢測方法。目標(biāo)物ATP和雙鏈DNA探針中的適體特異性結(jié)合,導(dǎo)致G四倍體鏈的釋放。ATP結(jié)合適體后被Exo III降解,釋放出目標(biāo)物ATP,釋放出的ATP可再次與雙鏈DNA探針中的適體鏈相結(jié)合,到達目標(biāo)循環(huán)放大的目的。由于目標(biāo)分子的循環(huán)擴增,被釋放的G四倍體序列鏈的量顯著增加。隨后,釋放出的G四倍體鏈與hemin結(jié)合,形成hemin/G四倍體DNAzyme,使得探針溶液的顏色發(fā)生劇烈變化,從而實現(xiàn)了靈敏的比色檢測ATP,檢測限低至0.33 nmol.L-1。我們構(gòu)建的傳感器顯示出良好的選擇性,并且可以在均相溶液中進行檢測,這使得我們的檢測方法在靈敏的比色檢測小分子和蛋白質(zhì)方面具有良好的應(yīng)用前景。
【關(guān)鍵詞】：DNA自組裝 DNA納米結(jié)構(gòu) 信號放大 生物傳感
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：O657.3;TP212
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-11
• 第一章 緒論11-27
• 1.1 瓦塊模式自組裝DNA納米結(jié)構(gòu)11-15
• 1.1.1 Holliday交叉結(jié)(Holliday junction)12
• 1.1.2 DNA雙交叉結(jié)構(gòu)(DNA double-crossover, DX)12-13
• 1.1.3 十字瓦塊(four-arm junctions)和多角形瓦塊13-14
• 1.1.4 單鏈組裝模塊14-15
• 1.1.5 T形組裝瓦塊（T-junction motif）15
• 1.2 DNA折紙術(shù)(DNA origami)15-16
• 1.3 信號放大技術(shù)在DNA納米結(jié)構(gòu)中的應(yīng)用16-25
• 1.3.1 基于酶催化的信號放大策略16-18
• 1.3.2 基于鏈置換信號放大方法18-21
• 1.3.3 基于納米材料的信號放大21-25
• 1.4 本論文研究背景及意義25-27
• 第二章 RNA調(diào)控的分子鉗子靈敏檢測癌細胞中micro RNA27-35
• 2.1 前言27-28
• 2.2 實驗部分28-29
• 2.2.1 材料及試劑28-29
• 2.2.2 制備的miR-141調(diào)控操作的DNA鉗子29
• 2.2.3 非變性凝膠電泳29
• 2.2.4 細胞培養(yǎng)以及制備的細胞裂解液29
• 2.2.5 實驗儀器29
• 2.3 結(jié)果與討論29-34
• 2.3.1 miR-141調(diào)控操作的DNA鉗子工作原理29-30
• 2.3.2 miR-141調(diào)控的DNA鉗子機器的特征30-32
• 2.3.3 DNA鉗子應(yīng)用于檢測miR-14132-33
• 2.3.4 從不同的癌細胞提取物中檢測miR-14133-34
• 2.4 總結(jié)34-35
• 第三章 microRNA誘導(dǎo)催化自組裝DNA納米結(jié)構(gòu)靈敏檢測癌細胞中的microRNA35-45
• 3.1 前言35-36
• 3.2 實驗部分36-38
• 3.2.1 材料與試劑36-37
• 3.2.2 瓊脂糖凝膠電泳37
• 3.2.3 聚丙型凝膠電泳37
• 3.2.4 細胞培養(yǎng)及制備的RNA提取液37
• 3.2.5 MicroRNA觸發(fā)DNA納米結(jié)構(gòu)的形成過程37-38
• 3.2.6 原子力顯微成像（AFM）38
• 3.2.7 動態(tài)光散射（DLS）38
• 3.2.8 熒光測量38
• 3.3 結(jié)果與討論38-44
• 3.3.1 miR-141觸發(fā)自組裝形成的DNA納米環(huán)的原理圖38-39
• 3.3.2 miR-141誘導(dǎo)自組裝DNA納米環(huán)的可行性分析39-41
• 3.3.3 實驗條件的優(yōu)化41-42
• 3.3.4 DNA納米環(huán)對目標(biāo)miR-141的響應(yīng)性能42-43
• 3.3.5 DNA納米環(huán)選擇性研究43
• 3.3.6 細胞樣品檢測43-44
• 3.4 總結(jié)44-45
• 第四章 末端保護的小分子鏈接的ssDNA用于游離且靈敏的比色法檢測葉酸受體45-53
• 4.1 前言45-46
• 4.2 實驗部分46-47
• 4.2.1 實驗試劑46
• 4.2.2 制備的FA-ssDNA46-47
• 4.2.3 末端保護的信號放大比色法檢測FR47
• 4.2.4 非變性凝膠電泳(PAGE)47
• 4.2.5 實驗儀器47
• 4.3 結(jié)果與討論47-52
• 4.3.1 末端保護的自組裝DNAzyme靈敏檢測FR的原理圖47-48
• 4.3.2 末端保護自組裝形成的DNAzyme可行性分析48-50
• 4.3.3 傳感器的性能研究50-51
• 4.3.4 血清樣品中FR的檢測51-52
• 4.4 總結(jié)52-53
• 第五章 基于未修飾的適體和DNAzyme用以目標(biāo)循環(huán)放大檢測ATP53-60
• 5.1 前言53-54
• 5.2 實驗部分54-55
• 5.2.1 實驗試劑54
• 5.2.2 實驗儀器54-55
• 5.2.3 傳感器的構(gòu)建過程55
• 5.3 結(jié)果與討論55-59
• 5.3.1 基于未修飾的適體和DNAzyme用以目標(biāo)循環(huán)放大的檢測ATP的機理55-56
• 5.3.2 比色法檢測ATP可行性分析56
• 5.3.3 實驗條件的優(yōu)化56-57
• 5.3.4 ATP適體傳感器性能研究57-58
• 5.3.4.1 傳感器對目標(biāo)物ATP的定量分析行為57-58
• 5.3.4.2 傳感器的選擇性58
• 5.3.5 傳感器在實際樣品中的應(yīng)用58-59
• 5.4 總結(jié)59-60
• 參考文獻60-70
• 在學(xué)期間發(fā)表的文章70-71
• 致謝71

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