本文關(guān)鍵詞：無需PCR擴(kuò)增靈敏檢測端粒酶活性新方法的研究

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【摘要】：端粒(telomere)是存在于真核細(xì)胞線狀染色體末端的一小段DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體,它能保持染色體的完整性和控制細(xì)胞分裂周期。由于DNA的不完全復(fù)制機(jī)制,細(xì)胞每次分裂,端粒就會縮短一點(diǎn),一旦端粒消耗殆盡,細(xì)胞凋亡機(jī)制就有可能被激活,細(xì)胞趨向凋亡。端粒酶(telomerase)是一種核蛋白逆轉(zhuǎn)錄酶,能在端粒3’末端催化合成端粒重復(fù)序列,使端粒不會由于細(xì)胞分裂而縮短,導(dǎo)致細(xì)胞永生化,成為腫瘤細(xì)胞。目前,已經(jīng)在85%以上的腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)端粒酶呈高活性表達(dá)。因此,端粒酶被認(rèn)為是一種普遍存在的腫瘤標(biāo)示物。端粒酶活性的檢測對于以端粒酶為靶點(diǎn)的腫瘤診斷和治療至關(guān)重要。目前已建立多種端粒酶活性檢測的方法,但仍存在靈敏度和可靠性等問題。因此,迫切需要發(fā)展能夠簡單快速、靈敏、可靠的檢測端粒酶活性的方法�；诖�,本文提出了端粒酶活性檢測的新策略,旨在發(fā)展能夠簡單、快速、可靠、低成本的檢測端粒酶活性靈敏的方法。本文的主要研究內(nèi)容可總結(jié)為以下三方面：一、基于三重放大技術(shù)在單細(xì)胞水平均相檢測端粒酶活性的熒光法基于三重放大技術(shù),構(gòu)建了一種無需PCR擴(kuò)增、無須標(biāo)記、靈敏檢測端粒酶活性的熒光新方法。以G-四鏈體選擇性染料,N-甲基卟啉二丙酸Ⅸ (NMM)為信號探針。以兩個莖部隱藏有能形成G-四鏈體序列的發(fā)夾型核酸片段作為鏈替代反應(yīng)(SDR)的DNA探針。端粒酶底物鏈在端粒酶的作用下,能夠?qū)⒍痰牡孜镦溠娱L成一條含有多個TTAGGG重復(fù)序列的長DNA單鏈。此DNA延長單鏈能夠與多個輔助DNA雜交,釋放出許多引發(fā)DNA (T-DNA)去引發(fā)鏈替代反應(yīng),實(shí)現(xiàn)第一步信號放大。其次,鏈替代反應(yīng)能夠在兩個打開的發(fā)夾末端形成兩個G-四鏈體實(shí)現(xiàn)第二步信號放大。最后,重新釋放的T-DNA能夠引發(fā)下一輪的鏈替代反應(yīng),使NMM的熒光信號進(jìn)一步累積增強(qiáng)。通過三重放大技術(shù),在均相溶液中,可在1-3000個HeLa細(xì)胞提取物范圍內(nèi)靈敏地檢測端粒酶的活性。同時,該方法能夠檢測正常細(xì)胞和不同種類腫瘤細(xì)胞中端粒酶活性表達(dá)的差異。此外,該方法也能用于評估端粒酶抑制劑對端粒酶活性的抑制效率。因此,該方法提供了一種簡單、可靠、不需要熒光標(biāo)記和酶輔助放大就能實(shí)現(xiàn)在單細(xì)胞水平靈敏檢測端粒酶活性的新方法。二、基于金納米顆粒信號放大靈敏檢測端粒酶活性的熒光偏振法熒光偏振是一種可在均相溶液中靈敏、可靠、穩(wěn)定地研究物質(zhì)間相互作用的方法。為了實(shí)現(xiàn)簡便可靠地檢測端粒酶的活性,我們首次構(gòu)建了無需PCR擴(kuò)增,基于金納米顆粒信號放大作用,在均相溶液中檢測端粒酶活性的熒光偏振法。首先,巰基化的端粒酶底物鏈TS,通過金-硫鍵作用,自組裝到金納米顆粒表面。當(dāng)存在端粒酶時,在底物鏈TS的3’末端延長出包含有多個TTAGGG重復(fù)序列的單鏈。這條延長鏈能夠與許多條標(biāo)記有羧基熒光素(FAM)的信號DNA分子(F-cDNA)互補(bǔ),將一部分自由活動的F-cDNA捕獲到金納米顆粒表面。在金納米顆粒的信號放大和端粒酶延長產(chǎn)物自放大的作用下,使F-cDNA的熒光偏振值FP增大。因此,在均相溶液中,在1-1000個HeLa細(xì)胞范圍內(nèi)能夠?qū)崿F(xiàn)端粒酶活性的快速檢測。同時,利用此方法可以測定不同種類細(xì)胞中端粒酶活性的表達(dá)水平。此外,還可用該方法考察端粒酶抑制劑對端粒酶活性的抑制效率,這對于篩選以端粒酶為靶點(diǎn)的抗癌藥物有潛在的應(yīng)用價(jià)值。因此,我們構(gòu)建了一種能夠在單細(xì)胞水平實(shí)現(xiàn)端粒酶活性快速靈敏檢測的方法,該方法具有簡單可靠、響應(yīng)速度快、成本低、靈敏度高等特點(diǎn)。三、基于三重放大技術(shù)檢測端粒酶活性的比色法基于三重放大技術(shù)增強(qiáng)G-四鏈體DNA酶催化作用,建立了一種無需標(biāo)記在均相溶液中檢測端粒酶活性的比色法。首先在活性端粒酶存在時,其底物的延長產(chǎn)物能夠與輔助DNA進(jìn)行競爭雜交反應(yīng),釋放多個鏈替代反應(yīng)的引發(fā)DNA(T-DNA)。T-DNA能夠引發(fā)發(fā)夾DNA H1和H2的自組裝鏈替代反應(yīng),在H1：H2的兩個末端分別形成G-四鏈體。氯化血紅素(hemin)存在時,會形成G-四鏈體-hemin DNA酶,其具有類辣根過氧化酶的催化作用,能夠催化H2O2-TMB體系顯色。通過溶液顏色的變化或者吸光度值的變化,可靈敏地檢測端粒酶的活性。利用裸眼能明顯的區(qū)分出相當(dāng)于10個HeLa細(xì)胞中端粒酶的活性,用吸光度值可以靈敏地檢測到相當(dāng)于1個HeLa細(xì)胞中端粒酶的活性。吸光度的變化與細(xì)胞個數(shù)在1-5000個細(xì)胞范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。本方法還可以測定不同種類細(xì)胞中端粒酶的活性,同時還可考察端粒酶抑制劑對端粒酶活性的抑制效率。該方法為簡便、低成本檢測端粒酶活性提供了一種新思路。
【關(guān)鍵詞】：熒光法 熒光偏振法 比色法 端粒酶活性 端粒酶抑制劑
【學(xué)位授予單位】：陜西師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：O657.3
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-11
• 第1章 緒論11-25
• 1.1 端粒、端粒酶11-15
• 1.1.1 端粒11-12
• 1.1.2 端粒酶12-14
• 1.1.3 端粒、端粒酶與腫瘤的關(guān)系14-15
• 1.2 端粒酶活性檢測15-24
• 1.2.1 檢測端粒酶活性的意義15-16
• 1.2.2 端�；钚匝芯糠椒�16-24
• 1.3 本課題研究內(nèi)容及意義24-25
• 第2章 基于三重放大技術(shù)在單細(xì)胞水平均相檢測端粒酶活性的熒光法25-41
• 2.1 引言25-26
• 2.2 實(shí)驗(yàn)部分26-30
• 2.2.1 試劑和儀器26-28
• 2.2.2 實(shí)驗(yàn)步驟28-30
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論30-39
• 2.3.1 原理驗(yàn)證30-33
• 2.3.2 凝膠電泳和圓二色光譜驗(yàn)證33-34
• 2.3.3 條件優(yōu)化34-35
• 2.3.4 靈敏度考察35-37
• 2.3.5 比較不同細(xì)胞中的端粒酶活性37-38
• 2.3.6 3'-疊氮-3'-脫氧胸苷(AZT)對端粒酶活性的抑制38-39
• 2.4 小結(jié)39-41
• 第3章 基于金納米顆粒信號放大靈敏檢測端粒酶活性的熒光偏振法41-55
• 3.1 引言41-42
• 3.2 實(shí)驗(yàn)部分42-45
• 3.2.1 試劑和儀器42-43
• 3.2.2 實(shí)驗(yàn)步驟43-45
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論45-54
• 3.3.1 實(shí)驗(yàn)原理45-46
• 3.3.2 表征功能化的金納米顆粒46-47
• 3.3.3 原理驗(yàn)證47-49
• 3.3.4 實(shí)驗(yàn)條件考察49-50
• 3.3.5 靈敏度測定50-52
• 3.3.6 不同種類細(xì)胞中端粒酶活性的測定52-53
• 3.3.7 端粒酶活性抑制劑的考察53-54
• 3.4 小結(jié)54-55
• 第4章 基于三重放大技術(shù)檢測端粒酶活性的比色法55-67
• 4.1 引言55-56
• 4.2 實(shí)驗(yàn)部分56-59
• 4.2.1 試劑和儀器56-57
• 4.2.2 實(shí)驗(yàn)步驟57-59
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論59-65
• 4.3.1 原理驗(yàn)證59-61
• 4.3.2 條件優(yōu)化61-63
• 4.3.3 靈敏度考察63-64
• 4.3.4 比較不同細(xì)胞中的端粒酶活性64-65
• 4.3.5 抑制劑考察65
• 4.4 小結(jié)65-67
• 結(jié)論67-69
• 參考文獻(xiàn)69-79
• 致謝79-81
• 攻讀學(xué)位期間研究成果81

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前7條

1 陳勇;趙傳奇;曲曉剛;;人類端粒DNA的分子識別及其作用機(jī)制探討[J];中國科學(xué):化學(xué);2012年12期

2 張子威;徐世文;;端粒酶活性在氯化鑭誘導(dǎo)MDCC-MSB1細(xì)胞凋亡中的作用[J];中國稀土學(xué)報(bào);2009年06期

3 許薇;;可預(yù)測壽命的“端粒測試”要上市[J];環(huán)境與生活;2011年06期

4 翁鈺t，

本文編號：857803