本文關(guān)鍵詞：多通道毛細(xì)管色譜柱裝填裝置研制及初步應(yīng)用

  更多相關(guān)文章： 毛細(xì)管色譜柱 毛細(xì)管色譜柱裝柱 糖蛋白質(zhì)定量 生物質(zhì)譜 金屬標(biāo)記

【摘要】：目前納升級(jí)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)技術(shù)已經(jīng)成為蛋白質(zhì)組研究的主流技術(shù)之一,液相色譜法的高效分離和質(zhì)譜的高靈敏分析是提高蛋白質(zhì)組的覆蓋率和定量準(zhǔn)確性的關(guān)鍵。而作為L(zhǎng)C-MS分析的關(guān)鍵技術(shù),液相分離的核心是液相色譜柱,它能直接決定樣品的分離度進(jìn)而影響定性和定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。選擇更小粒徑的填料和更長(zhǎng)的毛細(xì)管色譜柱可以有效地提高柱效、改善分離效果。對(duì)于這類毛細(xì)管色譜柱的制備以及目前色譜柱的大規(guī)模使用,目前常用的基于氣壓法裝填技術(shù)由于裝柱壓力小、速度慢,已經(jīng)不能滿足需求,且不同批次裝填的毛細(xì)管色譜柱柱效一致性不易保證。因此,本論文介紹了一種快速裝填這類毛細(xì)管色譜柱的裝置,并將以此裝置裝填得到的毛細(xì)管色譜柱應(yīng)用于蛋白質(zhì)組的定性和定量中。另外,蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)重要的執(zhí)行者,它的糖基化修飾是一種分布最為廣泛且非常重要的蛋白翻譯后修飾,幾乎參與了所有的生命過(guò)程而且存在于多種重大疾病中,如惡性腫瘤、糖尿病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等。因此糖基化修飾蛋白的研究對(duì)臨床診斷和治療具有重要的指導(dǎo)作用。但是,由于糖基化修飾屬于非模板合成,其微不均一性和低豐度表達(dá)給糖基化的研究帶來(lái)了較大的挑戰(zhàn)。因此,糖蛋白研究亟待一種高效快速的富集和定性定量研究方法。基于這個(gè)問(wèn)題,本文提出了一種N-糖蛋白的肼化學(xué)法結(jié)合鑭系金屬標(biāo)記相對(duì)定量的新方法。本論文由四章組成。第一章介紹了目前常用的蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法與技術(shù)及常用的毛細(xì)管色譜柱裝柱方法以及存在的優(yōu)缺點(diǎn)、適用范圍,也介紹了目前國(guó)內(nèi)外蛋白質(zhì)組特別是糖蛋白質(zhì)組的研究現(xiàn)狀和糖蛋白特別是N-糖蛋白常用的富集及定量技術(shù)。在第二章,對(duì)于目前實(shí)驗(yàn)室中常用的氣壓裝填毛細(xì)管色譜柱的方法提供壓力較小,不能滿足超長(zhǎng)毛細(xì)管色譜柱及亞2μm填料的毛細(xì)管色譜柱的裝柱需求,且對(duì)于填料粒徑3-5μm、長(zhǎng)15 cm左右的毛細(xì)管色譜柱裝柱效率低、耗時(shí)長(zhǎng)的問(wèn)題研究人員發(fā)展了一種液壓勻漿裝填毛細(xì)管色譜柱的方法,即采用高壓色譜泵提供壓力,與勻漿罐連接實(shí)現(xiàn)了毛細(xì)管色譜柱高效快速地裝填。但采用這種裝填方法一次僅能裝填一根毛細(xì)管色譜柱,裝柱效率低,不能滿足毛細(xì)管高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)快速發(fā)展和使用的需求。另外,不同批次裝填的毛細(xì)管色譜柱,其性能穩(wěn)定性不易保證。針對(duì)以上問(wèn)題,我們發(fā)展了一種以液相泵提供壓力,連接帶有磁力攪拌的六通道勻漿裝填毛細(xì)管色譜柱的新裝置。采用本裝置一次可以裝填多達(dá)6個(gè)毛細(xì)管色譜柱。以牛血清白蛋白(bsa)的胰蛋白酶酶解肽段混合物為樣本,選擇峰容量、蛋白覆蓋率、三個(gè)特定離子的保留時(shí)間以及毛細(xì)管色譜柱柱壓為指標(biāo),在毛細(xì)管液相色譜-質(zhì)譜儀聯(lián)用系統(tǒng)上對(duì)裝填的反相毛細(xì)管色譜柱的性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。在考察不同的磁力攪拌速度對(duì)色譜填料的影響時(shí),我們發(fā)現(xiàn)攪拌速度過(guò)大時(shí)會(huì)使填料破碎,從而影響柱效,特別是會(huì)使毛細(xì)管色譜柱柱壓明顯升高;我們還分別考察了一次裝填的6個(gè)毛細(xì)管色譜柱、兩次裝填的12個(gè)毛細(xì)管色譜柱以及一次裝填1個(gè)與一次裝填6個(gè)毛細(xì)管色譜柱的性能及穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:同一批次裝填的6個(gè)毛細(xì)管色譜柱的性能相近;不同批次裝填的12個(gè)毛細(xì)管色譜柱的峰容量和覆蓋率沒(méi)有明顯區(qū)別,但保留時(shí)間和毛細(xì)管色譜柱柱壓穩(wěn)定性較差;一次裝填1個(gè)和一次裝填6個(gè)毛細(xì)管色譜柱柱性能的穩(wěn)定性與兩次分別裝填6個(gè)毛細(xì)管色譜柱的穩(wěn)定性相近。即采用本裝置可顯著提高毛細(xì)管色譜柱的裝填效率且每次裝填毛細(xì)管色譜柱的個(gè)數(shù)不會(huì)對(duì)柱性能產(chǎn)生影響。在這些工作的基礎(chǔ)上,我們以本裝置裝填填料粒徑3μm、長(zhǎng)度分別為15cm和50cm的毛細(xì)管色譜柱并以酵母蛋白酶切產(chǎn)物來(lái)比較柱效;裝填長(zhǎng)度都為15cm、填料粒徑分別為1.8μm和3μm的毛細(xì)管色譜柱比較柱效。結(jié)果表明,更長(zhǎng)的毛細(xì)管色譜柱和更小粒徑的填料都能明顯提高柱效,而我們的毛細(xì)管色譜柱裝填裝置可以用于高效裝填這類色譜柱。第三章中介紹了一種n-糖蛋白的金屬元素標(biāo)記結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用的相對(duì)定量方法,該方法利用酰肼反應(yīng)原理將糖肽上的糖基與大環(huán)試劑dota結(jié)合,將修飾有鑭系金屬離子的磁性納米顆粒用來(lái)富集修飾有大環(huán)試劑的糖肽。不同樣本上修飾不同的鑭系金屬同時(shí)上樣,質(zhì)譜上分析后,通過(guò)比較信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到相對(duì)定量的目的。此方法的優(yōu)點(diǎn)在于富集與標(biāo)記同時(shí)進(jìn)行,能進(jìn)行糖基化位點(diǎn)鑒定和糖蛋白相對(duì)定量。我們合成了磷酸基團(tuán)修飾的磁性納米顆粒,顆粒大小均一、表面光滑、分散性好、超順磁性好、磷酸包覆效率高,可以在磁場(chǎng)的作用下和溶液分離,分離速度快、效率高,且其表面磷酸基團(tuán)含量高,能結(jié)合大量的金屬離子,可用于高效率富集結(jié)合有大環(huán)試劑的肽段。為避免肽段上的游離氨基干擾糖肽醛基與酰肼的反應(yīng),采用二甲基化反應(yīng)封閉肽段上的游離氨基,在此選取含有賴氨酸殘基的肽段進(jìn)行二甲基化反應(yīng)來(lái)考察,結(jié)果證明,用甲醛能將氨基端的氨基和氨基酸殘基上的氨基完全封閉。以上工作合成的磷酸基團(tuán)修飾的磁性納米材料及連有酰肼的dota大環(huán)試劑都為糖蛋白的富集及定量打下基礎(chǔ)。第四章是結(jié)論部分,對(duì)本文的工作做了歸納和總結(jié),概括本文工作的結(jié)果及其意義。
【關(guān)鍵詞】：毛細(xì)管色譜柱 毛細(xì)管色譜柱裝柱 糖蛋白質(zhì)定量 生物質(zhì)譜 金屬標(biāo)記
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：O657.7;Q503
【目錄】：

• 摘要5-8
• Abstract8-11
• 第一章 前言11-20
• 1.1 蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法及技術(shù)11-12
• 1.2 毛細(xì)管色譜柱裝柱技術(shù)12-13
• 1.2.1 電動(dòng)填充法12
• 1.2.2 氣壓勻漿裝填法12-13
• 1.2.3 液壓勻漿裝填法13
• 1.3 定量蛋白質(zhì)組學(xué)13-14
• 1.4 翻譯后修飾蛋白質(zhì)組學(xué)14-15
• 1.5 蛋白質(zhì)N-糖基化修飾研究技術(shù)15-18
• 1.5.1 蛋白質(zhì)糖基化修飾簡(jiǎn)介15-16
• 1.5.2 N-糖蛋白富集技術(shù)16-17
• 1.5.3 N-糖蛋白定量技術(shù)17-18
• 1.6 本論文的研究?jī)?nèi)容及選題意義18-20
• 第二章 一種多通道毛細(xì)管色譜柱裝填裝置的研制20-36
• 2.1 實(shí)驗(yàn)部分21-24
• 2.1.1 儀器與試劑21
• 2.1.2 試驗(yàn)方法21-24
• 2.1.2.1 勻漿溶劑的選擇21
• 2.1.2.2 磁攪拌條件的選擇21
• 2.1.2.3 多通道勻漿裝柱系統(tǒng)的設(shè)計(jì)和制造21-22
• 2.1.2.4 樣品前處理22
• 2.1.2.5 毛細(xì)管色譜柱裝填及柱效評(píng)價(jià)22-24
• 2.2 結(jié)果和討論24-35
• 2.2.1 裝柱勻漿溶劑的選擇24-25
• 2.2.2 磁攪拌條件的考察25-26
• 2.2.3 毛細(xì)管色譜柱的性能評(píng)價(jià)26-33
• 2.2.3.1 對(duì)一批裝填的一個(gè)毛細(xì)管6色譜柱的性能評(píng)價(jià)26-28
• 2.2.3.2 對(duì)一批裝填的6個(gè)毛細(xì)管色譜柱的性能評(píng)價(jià)28-30
• 2.2.3.3 對(duì)兩批裝填的12個(gè)色譜柱的性能評(píng)價(jià)30-31
• 2.2.3.4 對(duì)一次裝填1個(gè)和一次裝填6個(gè)毛細(xì)管色譜柱的比較31-33
• 2.2.4 本裝置的應(yīng)用33-35
• 2.2.4.1 以本裝置裝填超長(zhǎng)毛細(xì)管色譜柱33-34
• 2.2.4.2 以本裝置裝填亞2微米填料的毛細(xì)管色譜柱34-35
• 2.3 結(jié)論35-36
• 第三章N-糖蛋白金屬標(biāo)記結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)相對(duì)定量方法研究36-45
• 3.1 實(shí)驗(yàn)部分36-39
• 3.1.1 儀器與試劑36-37
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)方法37-39
• 3.1.2.1 磷酸化修飾的Fe3O4磁性納米顆粒的合成37
• 3.1.2.2 接有大環(huán)試劑的酰肼試劑的合成37-38
• 3.1.2.3 糖肽的前處理及標(biāo)記38-39
• 3.2 結(jié)果和討論39-44
• 3.2.1 磷酸化修飾的Fe3O4磁性納米顆粒的合成及表征39-41
• 3.2.2 接有大環(huán)試劑的酰肼試劑的合成及表征41-43
• 3.2.3 模型蛋白驗(yàn)證糖蛋白定量方案的可行性43-44
• 3.2.3.1 二甲基化效率考察43-44
• 3.3 結(jié)論44-45
• 第四章 結(jié)論45-47
• 參考文獻(xiàn)47-53
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷53-55
• 致謝55

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前9條

1 王義玲;;用硅溶膠制備強(qiáng)極性毛細(xì)管色譜柱[J];實(shí)驗(yàn)技術(shù)與管理;1998年02期

2 葉瑞洪 ,鄭建國(guó);用Monte Carlo方法模擬分析樣品在毛細(xì)管色譜柱中的傳輸過(guò)程[J];福建師大福清分校學(xué)報(bào);1996年02期

3 李新華,趙岷,寇登民;十二烷基苯磺酸鈣毛細(xì)管色譜柱的制備及其性能考查[J];南開大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2005年03期

4 錢慶榮，黃愛今;交聯(lián)PEG－20M玻璃毛細(xì)管色譜柱的研制[J];福建師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);1996年02期

5 龔健;李海濤;;用自制硅溶膠制備E-301玻璃毛細(xì)管色譜柱的研究[J];湖南師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào);1989年02期

6 上官云風(fēng),顏承農(nóng),謝修銀,臧旭,吳采櫻;套索冠醚毛細(xì)管色譜柱的性能研究[J];華中師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);1998年04期

7 黃愛今,許向群,展璞,孫亦梁;用臭氧引發(fā)制備SE-30、SE-54和含氰硅油毛細(xì)管色譜柱[J];北京大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);1989年04期

8 宏欣榮，龔健;高效SE-54交聯(lián)石英毛細(xì)管色譜柱的研制──100型層析儀的改裝與應(yīng)用[J];湘潭大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào);1994年01期

9 ;[J];;年期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前5條

1 孔德瑋;;高效毛細(xì)管色譜柱的研發(fā)和生產(chǎn)[A];甘肅省化學(xué)會(huì)第二十四屆年會(huì)論文集[C];2005年

2 ;直鏈?zhǔn)榛狡骄肿恿康拿?xì)管色譜測(cè)定法[A];天津市色譜研究會(huì)第一屆學(xué)術(shù)報(bào)告會(huì)論文、報(bào)告（摘要）匯集[C];1980年

3 田京鈺;鄭娟;朱芳;歐陽(yáng)鋼鋒;;碳納米管氣相毛細(xì)管色譜柱的制備及表征[A];第六屆全國(guó)環(huán)境化學(xué)大會(huì)暨環(huán)境科學(xué)儀器與分析儀器展覽會(huì)摘要集[C];2011年

4 韓霞;吳拓;;生物標(biāo)記物GC/MS/MS分析技術(shù)地化應(yīng)用[A];中國(guó)有機(jī)質(zhì)譜學(xué)第十二屆全國(guó)學(xué)術(shù)大會(huì)論文集[C];2003年

5 張凌燕;劉紅梅;鄒慧;張淑惠;楊曉媛;;乙烯三聚制1-己烯中試溶劑庚烷和產(chǎn)品組成的分析方法[A];中國(guó)化工學(xué)會(huì)2003年石油化工學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2003年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前4條

1 呂雅瑤;多通道毛細(xì)管色譜柱裝填裝置研制及初步應(yīng)用[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2016年

2 喻紅梅;同分異構(gòu)體專用毛細(xì)管柱的研制及應(yīng)用[D];南京工業(yè)大學(xué);2005年

3 龔成科;溶膠—凝膠法制備PLOT毛細(xì)管色譜柱[D];蘭州大學(xué);2010年

4 謝晶鑫;微分離系統(tǒng)中整體/混合毛細(xì)管色譜柱的制備與性能評(píng)價(jià)方法研究[D];沈陽(yáng)藥科大學(xué);2009年

，

本文編號(hào)：856266