發(fā)布時間：2017-09-12 13:26

  本文關(guān)鍵詞：自組裝DNA凝膠作為固定化酶載體的應(yīng)用研究

  更多相關(guān)文章： 固定化酶 超級三明治雜交反應(yīng) DNA凝膠 生物催化級聯(lián)反應(yīng)

【摘要】：固定化酶技術(shù)是現(xiàn)代生物催化的核心技術(shù)。通過酶固定有望提高酶的催化效率,提高回收率,延長酶的保質(zhì)期,為酶的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用以及工業(yè)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。固定化酶技術(shù)關(guān)鍵在于新型功能載體材料的研究與發(fā)展。DNA凝膠具有DNA的序列可編程性、便于合成與修飾,能夠可控組裝,并且具有較好的生物相容性,可降解性以及高的滲透性。這些優(yōu)點(diǎn)賦予了DNA凝膠作為載體材料在蛋白質(zhì)裝載、藥物裝載與釋放、胞外蛋白生產(chǎn)、DNA免疫治療等領(lǐng)域潛在的應(yīng)用前景。近年來DNA凝膠已經(jīng)被廣泛的用于固定和裝載客體分子,比如酶、蛋白質(zhì)和納米顆粒以及微米級的細(xì)胞。本文利用DNA凝膠可控組裝等優(yōu)點(diǎn),發(fā)展了DNA-蛋白質(zhì)雜合凝膠,實(shí)現(xiàn)了生物酶的固定；并且構(gòu)建了基于DNA凝膠的生物酶級聯(lián)反應(yīng)體系,具體內(nèi)容如下：1.基于DNA超級三明治雜交反應(yīng)和鏈霉親和素生物連接作用,構(gòu)建了DNA-蛋白質(zhì)雜合凝膠,實(shí)現(xiàn)了酒精氧化酶(AOx)的生物固定,提高了AOx的生物穩(wěn)定性。首先通過超級三明治雜交反應(yīng)形成具有周期性生物素的雜交雙鏈,加入鏈霉親和素以及客體生物分子AOx,基于同步組裝方法,構(gòu)建了DNA-蛋白質(zhì)凝膠,實(shí)現(xiàn)了AOx的有效包被。酶的裝載效率是42%,負(fù)載容量是18 mg AOx/g凝膠。形成的雜合凝膠直徑6.7±2.1 μm,類似于花朵狀,具有多孔的三維凝膠結(jié)構(gòu)。裝載在DNA-蛋白質(zhì)凝膠中AOx與血清培育24 h后,保持78%生物催化活性。基于DNA-蛋白質(zhì)凝膠表面的生物素位點(diǎn)和本身帶負(fù)電的特性,可以直接固定于鏈霉親和素修飾的96孔板以及氨基正電化的玻片上,實(shí)現(xiàn)了基于凝膠的AOx酶表面固定。在55℃加熱,與有機(jī)試劑DMSO培育,5次反復(fù)凍融的實(shí)驗(yàn)條件下,裝載在DNA-蛋白質(zhì)凝膠中的AOx表現(xiàn)出明顯增強(qiáng)的穩(wěn)定性。該方法充分利用DNA程序組裝的特點(diǎn),實(shí)現(xiàn)了生物酶的無損物理包被以及表面固定,提高了其生物穩(wěn)定性,有望應(yīng)用于生物酶傳感器等領(lǐng)域。2.基于氯化血紅素(Hemin)誘導(dǎo)組裝的DNA凝膠實(shí)現(xiàn)了氨基化葡萄糖氧化酶(GOx-NH2)的包載,同時構(gòu)建了GOx和G4-Hemin的復(fù)合酶級聯(lián)體系,實(shí)現(xiàn)了葡萄糖氧化與雙氧水降解的級聯(lián)催化。富含G4序列的DNA通過超級三明治雜交反應(yīng)形成雜交雙鏈,Hemin的加入,基于Hemin與G4序列的結(jié)合作用,觸發(fā)了DNA凝膠的形成。進(jìn)一步加入GOx-NH2,基于靜電作用力實(shí)現(xiàn)了GOx的凝膠包被。酶裝載效率達(dá)到73%。G4-Hemin DNA凝膠體系的過氧化氫催化能力增強(qiáng)增強(qiáng)了26倍。GOx和G4 hemin包載于凝膠中,實(shí)現(xiàn)了葡萄糖催化氧化和H202催化降解的反應(yīng)級聯(lián)。該DNA凝膠酶級聯(lián)反應(yīng)有望應(yīng)用于生物反應(yīng)器等領(lǐng)域。
【關(guān)鍵詞】：固定化酶 超級三明治雜交反應(yīng) DNA凝膠 生物催化級聯(lián)反應(yīng)
【學(xué)位授予單位】：湖南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q814.2;O648.17
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-11
• 本文所用英文縮略詞表11-12
• 第1章 緒論12-31
• 1.1 裝載與固定化研究12-13
• 1.2 裝載和固定化方法概述13-16
• 1.2.1 非化學(xué)結(jié)合法13-14
• 1.2.2 化學(xué)結(jié)合法14-15
• 1.2.3 包埋法15-16
• 1.3 酶的裝載和固定化載體材料16-19
• 1.3.1 預(yù)制型載體材料16-18
• 1.3.2 免預(yù)制型載體材料18-19
• 1.3.3 免載體交聯(lián)型載體材料19
• 1.4 DNA凝膠的研究進(jìn)展19-29
• 1.4.1 DNA凝膠的概念19-22
• 1.4.2 DNA凝膠的制備與表征22-25
• 1.4.3 DNA凝膠的應(yīng)用25-29
• 1.5 本文擬開展的研究工作29-31
• 第2章 自組裝DNA-蛋白質(zhì)凝膠用于酒精氧化酶的固定31-46
• 2.1 前言31
• 2.2 實(shí)驗(yàn)部分31-35
• 2.2.1 試劑與儀器31-32
• 2.2.2 DNA-蛋白質(zhì)雜合凝膠的制備32-33
• 2.2.3 DNA-蛋白質(zhì)凝膠用于酶固定33
• 2.2.4 AOx酶活的檢測33-34
• 2.2.5 MTT生物相容性考察34
• 2.2.6 血清中的乙醇催化氧化34-35
• 2.2.7 凝膠介導(dǎo)酶的表面固定35
• 2.2.8 酶的生物穩(wěn)定性考察35
• 2.3 結(jié)果與討論35-44
• 2.3.1 DNA-蛋白質(zhì)凝膠的自組裝原理35-36
• 2.3.2 超級三明治雜交鏈的表征36-37
• 2.3.3 DNA-蛋白質(zhì)凝膠的表征37-38
• 2.3.4 酶的凝膠裝載原理38-39
• 2.3.5 酶裝載于凝膠的結(jié)構(gòu)表征39-41
• 2.3.6 血清中酶催化氧化乙醇41-42
• 2.3.7 凝膠介導(dǎo)酶的表面固定42-43
• 2.3.8 凝膠中AOx穩(wěn)定性考察43-44
• 2.4 小結(jié)44-46
• 第3章 基于G4-Hemin DNA凝膠的生物酶級聯(lián)反應(yīng)載體研究46-61
• 3.1 前言46
• 3.2 實(shí)驗(yàn)部分46-51
• 3.2.1 主要儀器和試劑46-47
• 3.2.2 DNA的序列設(shè)計47-48
• 3.2.3 超級三明治雜交實(shí)驗(yàn)48
• 3.2.4 Hemin誘導(dǎo)組裝G4-Hemin DNA凝膠48
• 3.2.5 G4-Hemin的雙氧水催化考察48-50
• 3.2.6 G4-Hemin DNA凝膠固定GOx-NH_250-51
• 3.2.7 G4-Hemin DNA凝膠作為酶級聯(lián)反應(yīng)的載體51
• 3.3 結(jié)果與討論51-60
• 3.3.1 G4-Hemin DNA凝膠構(gòu)建原理51-52
• 3.3.2 DNA序列設(shè)計的軟件模擬52-53
• 3.3.3 超級三明治雜交鏈的表征53-54
• 3.3.4 G4-Hemin DNA凝膠的催化能力考察54-55
• 3.3.5 米氏催化常數(shù)的考察55-56
• 3.3.6 GOx的陽離子化表征56-57
• 3.3.7 G4-Hemin DNA凝膠裝載GOx-NH_257-59
• 3.3.8 催化酶級聯(lián)反應(yīng)59-60
• 3.4 小結(jié)60-61
• 結(jié)論61-62
• 參考文獻(xiàn)62-69
• 附錄A 攻讀學(xué)位期間所發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄69-70
• 致謝70

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本文編號：837483