本文關(guān)鍵詞：超高靜壓對白芥子中芥子酶催化反應(yīng)的影響機制研究

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【摘要】：芥子酶能夠催化硫代葡萄糖苷類物質(zhì)生成具有抗癌功效的異硫氰酸酯,具有重要的研究價值。本研究以白芥子中芥子酶為對象,對其酶學(xué)特性進行研究,并從酶活力、反應(yīng)動力學(xué)以及酶構(gòu)象等方面分析超高靜壓對芥子酶催化反應(yīng)的影響,同時研究了壓力及多羥基醇對酶熱穩(wěn)定性和反應(yīng)進程的影響。彌補芥子酶在超高靜壓處理方面的研究空白,拓展芥子酶在食品加工中的應(yīng)用。1.通過硫酸銨分級沉淀、透析、ConA親和柱層析等方法從白芥子中提取、分離和純化得到芥子酶。結(jié)果顯示,0~20%硫酸銨飽和度部分提取所得酶液比活力最大,為7.8U/mg,所以用作后續(xù)酶學(xué)特性的研究。2.利用SDS-Page測定分子量、利用葡萄糖試劑盒法和高效液相色譜測定酶活,對芥子酶酶學(xué)特性進行研究。結(jié)果表明,白芥芥子酶的分子量約為75 kDa,最適pH為7,最適溫度為55°C;NaCl溶液對芥子酶活力有抑制作用;Vc能有效地促進酶活,添加0.1mmol/L Vc時的酶活為對照組的4.8倍;酶濃度與酶活并非呈線性正相關(guān)關(guān)系;常壓(0.1MPa)下的米氏常數(shù)Km=1.265 mmol/L,最大反應(yīng)速度Vmax=0.150 mmol/min。3.研究了超高靜壓下不同因素對芥子酶催化反應(yīng)的影響。這些因素包括:壓力強度、pH、緩沖液、處理時間和酶穩(wěn)定劑(多羥基醇)等。研究發(fā)現(xiàn):(1)200~600 MPa壓力強度均降低芥子酶活力,且600 MPa下酶水解底物的能力僅為對照組的0.53倍。(2)在超高靜壓下研究不同pH值、不同緩沖液類型對酶活的影響,發(fā)現(xiàn)芥子酶在pH為6時活力最高,但其活力受緩沖液類型影響較大,其中芥子酶在乙酸銨緩沖液中的穩(wěn)定性較好。(3)研究不同保壓時間對酶活力的影響,結(jié)果表明增大保壓時間(從1 min延長至20 min)對酶活力的影響較小,ANOVA分析顯示保壓時間對酶活的影響無統(tǒng)計學(xué)差異。(4)研究酶穩(wěn)定劑多羥基醇(甘油和山梨醇)對芥子酶熱穩(wěn)定性的影響,結(jié)果表明超高靜壓處理使得芥子酶的熱穩(wěn)定性降低,但多羥基醇在一定條件下可起到有效的保護作用;在添加0.1 mol/L的甘油的情況下,較高溫度時(65°C),甘油對芥子酶起一定的保護作用,使得芥子酶的熱穩(wěn)定性提高;添加3 mol/L的山梨醇也同樣能提高芥子酶的熱穩(wěn)定性。研究多羥基醇對芥子酶催化反應(yīng)的影響,表明常壓下甘油可促進芥子酶催化反應(yīng)進程,但影響較小;而山梨醇在常壓及高壓下均能促進芥子酶催化反應(yīng)進程,且高壓下促進效果較常壓更顯著。(5)研究了不同壓力下芥子酶的動力學(xué)參數(shù),可知超高靜壓處理提高了芥子酶與底物的結(jié)合能力,Km值在100~600 MPa范圍內(nèi)隨著壓力的升高先減小后增大,但均低于常壓下的值。隨著壓力的增大,最大反應(yīng)速率Vmax表現(xiàn)出下降的趨勢。研究得到了0.1~600MPa/常溫(25°C)條件下芥子酶的反應(yīng)活化體積,為△V!=4.46 cm3/mol,即提高壓力會降低酶催化反應(yīng)速度。4.研究了超高靜壓處理對純化后的芥子酶酶活的影響,并通過圓二色光譜、熒光光譜測定了超高靜壓處理對酶構(gòu)象的影響。結(jié)果表明,超高靜壓下純化后的芥子酶活力得到提高,酶蛋白表面的二硫鍵含量也升高;超高靜壓使芥子酶純品的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化,隨著壓力的增大,"-螺旋含量降低,#-折疊含量升高;同時,超高靜壓影響了芥子酶純品的三級結(jié)構(gòu),使更多疏水性的Trp暴露于極性環(huán)境中,熒光強度增強。
【關(guān)鍵詞】：超高靜壓 芥子酶 催化反應(yīng) 酶活 構(gòu)象
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：O629.8
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 第一章 緒論10-21
• 1.1 芥子酶及其研究進展10-15
• 1.2 超高靜壓及其研究進展15-19
• 1.3 研究內(nèi)容和目的19-20
• 1.4 創(chuàng)新之處20-21
• 第二章 芥子酶的提取分離21-31
• 2.1 引言21
• 2.2 實驗試劑及儀器21-22
• 2.3 實驗方法22-26
• 2.4 結(jié)果與討論26-30
• 2.5 本章小結(jié)30-31
• 第三章 芥子酶酶學(xué)特性的研究31-40
• 3.1 引言31
• 3.2 實驗試劑及儀器31-32
• 3.3 實驗方法32-35
• 3.4 結(jié)果與討論35-39
• 3.5 本章小結(jié)39-40
• 第四章 超高靜壓對芥子酶催化反應(yīng)的影響40-54
• 4.1 引言40
• 4.2 實驗試劑及儀器40-41
• 4.3 實驗方法41-43
• 4.4 結(jié)果與討論43-53
• 4.5 本章小結(jié)53-54
• 第五章 超高靜壓對芥子酶構(gòu)象的影響54-63
• 5.1 引言54
• 5.2 實驗試劑及儀器54
• 5.3 實驗方法54-57
• 5.4 結(jié)果與討論57-61
• 5.5 本章小結(jié)61-63
• 第六章 結(jié)論與展望63-65
• 6.1 結(jié)論63-64
• 6.2 展望64-65
• 參考文獻65-72
• 在校期間論文發(fā)表情況72-73
• 致謝73

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本文編號：814005