本文關鍵詞：聚電解質多層膜實現(xiàn)動態(tài)界面硬度用于原位調控細胞行為的研究

  更多相關文章： 層狀組裝多層膜 動態(tài)硬度 成纖維細胞 內(nèi)皮細胞 內(nèi)皮化

【摘要】：研究表明,除了表面化學組成和拓撲結構以外,材料的物理機械性能---硬度,對細胞的黏附、增殖、分化、遷移等一系列行為也會產(chǎn)生重大影響。在生物體內(nèi),細胞所處的微環(huán)境是動態(tài)變化的,其中硬度也會隨之發(fā)生改變。目前基于硬度對細胞行為的材料設計研究集中在水凝膠材料中,且硬度變化以靜態(tài)為主。隨著層層組裝多層膜技術的發(fā)展,制備硬度可控的微納尺寸的層狀組裝多層膜技術也受到越來越多研究者的重視。本課題研究以層狀組裝多層膜技術為基礎,利用二硫鍵的可逆性,構建了具有動態(tài)界面硬度的多層膜方法,進一步探索了該動態(tài)硬度界面對細胞行為的影響規(guī)律。首先我們制備了巰基修飾的透明質酸(HA-SH),通過層層組裝技術構建聚賴氨酸/透明質酸(PLL/HA-SH)n多層膜。石英晶體微天平(QCM)結果證明HA-SH可以和PLL進行層層組裝構建多層膜。共聚焦顯微鏡結果顯示12雙層多層膜厚度在3.4μm左右,分布均勻。紫外可見吸收光譜(UV-vis)結果顯示,多層膜中的巰基在氯胺T(CaT)的氧化作用下,90%的巰基在1min內(nèi)就被氧化成二硫鍵,從而使多層膜得到交聯(lián)。原子力顯微鏡測定的楊氏模量結果顯示,交聯(lián)后的多層膜的硬度可以由60±7.6 kPa提高到210±10 kPa,在還原劑谷胱甘肽(GSH)的還原作用下,其硬度可以還原到未交聯(lián)的程度。以成纖維細胞3T3為細胞模型的細胞實驗證明,3T3細胞無法粘附在未交聯(lián)的多層膜上,而在交聯(lián)后的多層膜表面可以很好的黏附、增殖。原位對多層膜進行GSH處理,使多層膜解交聯(lián),10小時后,細胞的形貌會發(fā)生變化：由鋪展狀態(tài)變?yōu)榛乜s狀態(tài),同時細胞活性也降低將近30%。通過構建二硫鍵可逆交聯(lián)的多層膜,我們實現(xiàn)了對材料表面硬度的原位調節(jié),進一步實現(xiàn)了對細胞黏附行為的原位調控。在心血管植入材料表面的內(nèi)皮化過程中,首先內(nèi)皮細胞在材料表面需要快速黏附和增殖。其次,當內(nèi)皮細胞完全覆蓋材料表面后,新生的內(nèi)皮層行使正常的內(nèi)皮功能。研究表明,提高材料表面硬度有利于內(nèi)皮細胞的黏附和增殖,而硬度的降低則能夠促進內(nèi)皮功能。因此,構建動態(tài)硬度界面材料,能夠促進內(nèi)皮細胞內(nèi)皮化的過程。我們選用CaT交聯(lián)的PLL/HA-SH多層膜表面作為硬度動態(tài)界面。首先在多層膜上培養(yǎng)內(nèi)皮,形成完整的內(nèi)皮層。隨后在培養(yǎng)基中加入谷胱甘肽(GSH),原位實現(xiàn)PLL/HA-SH多層膜的解交聯(lián),降低材料硬度。并深入表征了內(nèi)皮層的形貌、致密性、凝血酶刺激后的形貌變化,一氧化氮分泌量。數(shù)據(jù)顯示,交聯(lián)的(PLL/HA-SH)多層膜能夠促進內(nèi)皮細胞的黏附和增殖,形成內(nèi)皮層。內(nèi)皮層在GSH降解后的多層膜表面,有著更好的致密性,并顯現(xiàn)出更高的一氧化氮分泌量。
【關鍵詞】：層狀組裝多層膜 動態(tài)硬度 成纖維細胞 內(nèi)皮細胞 內(nèi)皮化
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q2-33;O631
【目錄】：

• 致謝4-6
• 摘要6-8
• ABSTRACT8-13
• 第一章 緒論13-35
• 1.1 細胞外微環(huán)境對細胞行為的影響13-17
• 1.1.1 細胞外基質13-14
• 1.1.2 細胞外基質的物理因素---硬度14-16
• 1.1.3 界面硬度對成纖維細胞3T3和內(nèi)皮細胞的影響16-17
• 1.2 層層組裝多層膜的物理機械性能調控17-29
• 1.2.1 層層組裝技術17-22
• 1.2.2 多層膜界面硬度的調控22-25
• 1.2.3 動態(tài)界面25-29
• 1.3 二硫鍵的結構及其性質29-33
• 1.3.1 二硫鍵在生物醫(yī)用方面的應用29-31
• 1.3.2 二硫鍵在多層膜中的應用31-33
• 1.4 課題提出及研究思路33-35
• 第二章 基于二硫鍵構建動態(tài)硬度界面原位觀察3T3細胞的變化35-52
• 2.1 引言35-36
• 2.2 實驗部分36-42
• 2.2.1 化學試劑36-37
• 2.2.2 主要儀器及表征37
• 2.2.3 HA-SH合成37-38
• 2.2.4 核磁共振波譜儀(~1HNMR)38
• 2.2.5 Ellman檢測巰基含量38-39
• 2.2.6 組裝液配置和多層膜的構建39
• 2.2.7 多層膜的表征39
• 2.2.8 激光共聚焦顯微鏡(CLSM)39-40
• 2.2.9 多層膜上巰基的定量計算40
• 2.2.10 多層膜的交聯(lián)40
• 2.2.11 楊氏模量的測定40
• 2.2.12 胞的培養(yǎng)40-41
• 2.2.13 細胞毒性研究41-42
• 2.3 結果與討論42-51
• 2.3.1 HA-SH的合成42
• 2.3.2 Ellman's方法檢測巰基的含量42-43
• 2.3.3 QCM-D跟蹤多層膜的組裝43-44
• 2.3.4 共聚焦顯微鏡觀察(PLL/HA-SH)_(12)的縱向結構和濕態(tài)厚度44-45
• 2.3.5 多層膜的交聯(lián)45-46
• 2.3.6 多層膜硬度的測定46-47
• 2.3.7 胞黏附實驗47-49
• 2.3.8 細胞對動態(tài)硬度變化的響應49-51
• 2.4 本章小結51-52
• 第三章 柔性多層膜提升內(nèi)皮細胞活性與維持內(nèi)皮細胞功能52-62
• 3.1 引言52
• 3.2 實驗部分52-55
• 3.2.1 多層膜的組裝與交聯(lián)53-54
• 3.2.2 多層膜楊氏模量的測定54
• 3.2.3 細胞的培養(yǎng)54
• 3.2.4 內(nèi)皮細胞的增殖實驗54
• 3.2.5 內(nèi)皮細胞的表征54-55
• 3.2.6 內(nèi)皮細胞致密性的表征55
• 3.2.7 一氧化氮(NO)的檢測55
• 3.3 實驗結果與討論55-61
• 3.3.1 多層膜楊氏模量的測定55-56
• 3.3.2 內(nèi)皮細胞的黏附和增殖56-57
• 3.3.3 GSH對內(nèi)皮層的影響57-59
• 3.3.4 內(nèi)皮層形貌和致密性的表征59-60
• 3.3.5 NO的檢測60-61
• 3.4 本章小結61-62
• 第四章 全文主要結論、創(chuàng)新和展望62-64
• 全文結論62
• 特色與創(chuàng)新62-63
• 問題與展望63-64
• 參考文獻64-74
• 作者簡介74

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