本文關(guān)鍵詞：基于酶催化信號(hào)擴(kuò)增電化學(xué)檢測(cè)DNA甲基化及其應(yīng)用研究

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【摘要】：DNA甲基化是基因組中的一種重要的表觀遺傳修飾,在原核生物和真核生物生長(zhǎng)發(fā)育中扮演重要的角色。異常的DNA甲基化與各種疾病有關(guān),例如癌癥。眾所周知,DNA甲基化是在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases,DNMT)的作用下,以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體,將甲基轉(zhuǎn)移到5'-CG-3'序列(CpG)的胞嘧啶5位碳上,生成5-甲基胞嘧啶,或者將甲基轉(zhuǎn)移到腺嘌呤的6位碳上。因此DNA甲基化水平與甲基轉(zhuǎn)移酶活性息息相關(guān),檢測(cè)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性和抑制因子篩選有重要意義。目前,DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的檢測(cè)方法主要有放射性標(biāo)記、重硫酸鹽處理、比色和高效液相法等。但這些方法存在一些缺點(diǎn),如放射性標(biāo)記法對(duì)生物組織有傷害,重硫酸鹽處理將胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶耗時(shí)長(zhǎng),比色法雖然簡(jiǎn)單,但金納米粒子容易聚沉,高效液相色譜法需要大型儀器成本高。因此,發(fā)展簡(jiǎn)單、快速DNA甲基化和甲基轉(zhuǎn)移酶活性的分析方法非常必要。5-hmC被認(rèn)為是基因中的第六種堿基,主要分布于神經(jīng)元細(xì)胞,小鼠腦細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞中。同時(shí),在許多種癌細(xì)胞中它的含量相對(duì)于正常細(xì)胞降低。因此,5-hmC的表達(dá)水平可以作為檢測(cè)癌癥的標(biāo)志物。目前檢測(cè)5-hmC的方法有薄層色譜法、高效液相法、酶催化放射性標(biāo)記法等,但是這些方法都有許多缺點(diǎn)。例如,高效液相法需要大型儀器,酶催化放射性標(biāo)記法傷害生物組織。因此,依然需要發(fā)展一種簡(jiǎn)單、快速檢測(cè)基因組DNA中5-hmC的方法。本文利用CdS量子點(diǎn)、Bi2S3光電納米材料、生物酶和抗體等,并通過(guò)酶催化放大技術(shù),制備了兩種光電化學(xué)生物傳感器和兩種電化學(xué)生物傳感器,對(duì)甲基轉(zhuǎn)移酶活性進(jìn)行了分析并且對(duì)細(xì)胞中5-hmC的含量進(jìn)行了檢測(cè)。(1)本文利用Bi2S3光電納米材料和酶催化信號(hào)放大技術(shù)制備了一種用于M.Sss I甲基轉(zhuǎn)移酶活性分析和其抑制因子篩選的光電生物傳感器。5-m C抗體作為識(shí)別單元,SA-AuNPs作為信號(hào)擴(kuò)增單元,ALP作為酶催化單元。在甲基轉(zhuǎn)移酶存在的情況下,發(fā)卡DNA可以被甲基化。當(dāng)與生物素修飾的DNA雜交后形成雙鏈DNA(ds-DNA),ds-DNA可以被俘獲到抗體修飾的電極表面,隨后SA-AuNPs和ALP-biotin可以通過(guò)生物素與鏈霉親和素的特異性識(shí)別依次被俘獲到電極表面。堿性磷酸酯酶(ALP)原位催化水解L-抗壞血酸-2-磷酸三鈉鹽產(chǎn)生抗壞血酸分子作為電子供體,從而增強(qiáng)光電信號(hào)。制備的傳感器表現(xiàn)出了很好的靈敏性,對(duì)甲基轉(zhuǎn)移酶檢測(cè)限為0.33 unit/mL。而且,對(duì)抑制劑的篩選證明RG108對(duì)甲基轉(zhuǎn)移酶活性有抑制作用,半數(shù)抑制量為152.54 nM。(2)基于G-四連體和ExoIII的電化學(xué)傳感器檢測(cè)甲基轉(zhuǎn)移酶活性。首先,探針雙鏈DNA固定到金電極表面,隨后將DNA甲基轉(zhuǎn)移酶滴加到電極表面,甲基化后用DpnI切割。這樣甲基化的DNA鏈可以被ExoIII消解釋放富含G的DNA單鏈。在氯化血紅素和鉀離子存在的情況下,其可以形成氯化血紅素/G-四連體結(jié)構(gòu)。氯化血紅素/G-四連體可以在雙氧水存在的情況下催化對(duì)苯二酚生成苯醌。苯醌可以產(chǎn)生較大的電信號(hào)。最后我們用還原石墨烯修飾的金電極作為工作電極進(jìn)行電化學(xué)測(cè)量。制備的電化學(xué)傳感器展現(xiàn)了較好的靈敏度。對(duì)DAM甲基轉(zhuǎn)移酶的檢測(cè)限為0.31 unit·m L-1。抑制劑的研究表明,表兒茶素能夠抑制DAM甲基轉(zhuǎn)移酶活性,半數(shù)抑制量為157μM。(3)基于5-hmC抗體,生物素功能化的phos-tag(Phos-tag-biotin)和親和素修飾的堿性磷酸酯酶(avidin-ALP)的電化學(xué)免疫傳感器定量檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞中的5-hmC。5-hmC抗體作為識(shí)別單元,Phos-tag-biotin作為連接單元,avidin-ALP作為酶催化信號(hào)擴(kuò)增單元。首先5-羥甲基胞嘧啶脫氧核苷酸被俘獲到抗體修飾的電極表面,之后Phos-tag-biotin通過(guò)與磷酸根的作用俘獲到電極表面。最后,avidin-ALP通過(guò)親和素和生物素的特異性結(jié)合作用固定到電極表面。通過(guò)ALP催化對(duì)硝基苯磷酸二鈉產(chǎn)生電活性分子對(duì)硝基苯酚。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,制備的電化學(xué)免疫傳感器展現(xiàn)出了很好的靈敏度,檢測(cè)限為0.032nM。而且通過(guò)制備的電化學(xué)免疫傳感器成功的對(duì)乳腺癌細(xì)胞中的5-hmC含量進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)與正常乳腺細(xì)胞比較,5-hmC在乳腺癌細(xì)胞中的含量大量降低。(4)基于原位產(chǎn)生電子供體和全波長(zhǎng)光作為激發(fā)光的策略制備光電傳感器檢測(cè)5-hmC。首先,通過(guò)酰胺鍵將氨基修飾的探針DNA固定到羧基修飾的磁性微球表面。在M.HhaI和半胱胺存在的條件下,含有5-hmC的探針DNA可以被氨基化。隨后NHS-biotin能夠被標(biāo)記到氨基化的DNA鏈上。隨后通過(guò)親和素和生物素的特異性結(jié)合作用將親和素修飾的ALP可以被俘獲到磁性微球表面。ALP原位催化水解L-抗壞血酸-2-磷酸三鈉鹽產(chǎn)生抗壞血酸作為電子供體。磁分離后,在全波長(zhǎng)的光照射下以CdS修飾的ITO作為工作電極進(jìn)行光電檢測(cè)。制備的傳感器展現(xiàn)出了很好的靈敏度,檢測(cè)限為0.167 nM。
【關(guān)鍵詞】：DNA甲基化 生物傳感器 表觀遺傳學(xué)
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q75;O657.1
【目錄】：

• 符號(hào)說(shuō)明4-9
• 中文摘要9-11
• Abstract11-14
• 1 前言14-23
• 1.1 表觀遺傳學(xué)14
• 1.1.1 表觀遺傳學(xué)概述14
• 1.1.2 表觀遺傳學(xué)研究?jī)?nèi)容14
• 1.2 DNA甲基化概述14-15
• 1.2.1 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性抑制劑14-15
• 1.3 DNA甲基化檢測(cè)技術(shù)15-17
• 1.3.1 亞硫酸鹽方法檢測(cè)DNA甲基化15-16
• 1.3.2 高效液相色譜法16
• 1.3.3 敏感甲基化單個(gè)核苷酸引物延伸法16-17
• 1.3.4 電化學(xué)方法17
• 1.4 DNA羥甲基化概述17-18
• 1.5 DNA羥甲基檢測(cè)技術(shù)18-19
• 1.6 電化學(xué)生物傳感器19-20
• 1.6.1 酶信號(hào)擴(kuò)增電化學(xué)生物傳感器19
• 1.6.3 電化學(xué)免疫傳感器19
• 1.6.4 電化學(xué)DNA傳感器19-20
• 1.7 光電化學(xué)生物傳感器20-21
• 1.8 本課題的提出及主要研究?jī)?nèi)容21-23
• 2 材料與方法23-35
• 2.1 儀器與試劑23-26
• 2.1.1 儀器23-24
• 2.1.2 試劑24-25
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)中主要緩沖溶液的配置25-26
• 2.2 試驗(yàn)方法26-35
• 2.2.1 基于信號(hào)擴(kuò)增策略的光電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)甲基轉(zhuǎn)移酶活性26-29
• 2.2.1.1 Au納米粒子的制備26
• 2.2.1.2 鏈霉親和素標(biāo)記納米金26-27
• 2.2.1.3 硫化鉍的制備27
• 2.2.1.4 ITO電極預(yù)處理27
• 2.2.1.5 生物傳感器的制備27-28
• 2.2.1.6 光電化學(xué)信號(hào)檢測(cè)28-29
• 2.2.1.7 生物傳感器的選擇性和抑制因子的篩選29
• 2.2.1.8 光電材料穩(wěn)定性檢測(cè)29
• 2.2.2 基于G-四連體和外切酶III的電化學(xué)方法檢測(cè)Dam甲基轉(zhuǎn)移酶活性29-31
• 2.2.2.1 電極預(yù)處理29-30
• 2.2.2.2 工作電極的制備30
• 2.2.2.3 探針DNA的固定30
• 2.2.2.4 DNA甲基化及酶切處理30
• 2.2.2.5 G-四連體的形成30
• 2.2.2.6 電化學(xué)信號(hào)檢測(cè)30-31
• 2.2.2.7 生物傳感器選擇性檢測(cè)和抑制因子的篩選。31
• 2.2.3 基于全光照射的光電生物傳感器檢測(cè)DNA羥甲基化。31-33
• 2.2.3.1 CdS量子點(diǎn)的制備和工作電極31
• 2.2.3.2 磁性微球?qū)﹄p鏈DNA的固定31-32
• 2.2.3.3 氨基-衍生化 5-hmC32
• 2.2.3.4 NHS-生物素和親和素標(biāo)記的堿性磷脂酶的固定32
• 2.2.3.5 光電信號(hào)測(cè)量32-33
• 2.2.3.8 特異性檢測(cè)33
• 2.2.4 基于電化學(xué)免疫傳感器定量分析乳腺癌細(xì)胞中的 5-hmC33-35
• 2.2.4.1 玻碳電極預(yù)處理33
• 2.2.4.2 石墨烯-傒四羧酸（GR-PTCA）的制備33-34
• 2.2.4.3 生物傳感器的制備34
• 2.2.4.4 工作電極的制備34
• 2.2.4.5 電化學(xué)檢測(cè)34-35
• 2.2.4.6 實(shí)際樣品的檢測(cè)35
• 3 結(jié)果與分析35-48
• 3.1 基于信號(hào)增加的光電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)甲基轉(zhuǎn)移酶活性35-38
• 3.1.1 EIS分析和可行性分析35-36
• 3.1.2 優(yōu)化甲基化時(shí)間36-37
• 3.1.3 甲基轉(zhuǎn)移酶活性的檢測(cè)37-38
• 3.1.4 抑制因子的篩選38
• 3.2 基于G-四連體和外切酶III的電化學(xué)方法檢測(cè)Dam甲基轉(zhuǎn)移酶活性38-41
• 3.2.1 實(shí)驗(yàn)可行性分析38-39
• 3.2.2 Dam甲基轉(zhuǎn)移酶活性分析39-40
• 3.2.3 精確性，重現(xiàn)性和特異性分析40
• 3.2.4 抑制因子的篩選40-41
• 3.3 基于全光射的的光電生物傳感器檢測(cè)DNA羥甲基化41-44
• 3.3.1 實(shí)驗(yàn)可行性分析41-42
• 3.3.2 條件優(yōu)化42
• 3.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，傳感器選擇性和重現(xiàn)性的分析42-44
• 3.4 基于電化學(xué)免疫傳感器定量分析乳腺癌細(xì)胞中的 5-hmC44-48
• 3.4.1 EIS和可行性分析44-45
• 3.4.2 條件優(yōu)化45
• 3.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，，特異性和重現(xiàn)性分析45-46
• 3.4.5 實(shí)際樣品檢測(cè)46-48
• 4 討論48-51
• 4.1 基于信號(hào)增加策略的光電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)甲基轉(zhuǎn)移酶活性48
• 4.2 基于G-四連體和外切酶III的電化學(xué)方法檢測(cè)Dam甲基轉(zhuǎn)移酶活性48-49
• 4.3 基于全光射的光電生物傳感器檢測(cè)DNA羥甲基化49-50
• 4.4 基于電化學(xué)免疫傳感器定量分析乳腺癌細(xì)胞中的 5-hmC50-51
• 5. 結(jié)論51-52
• 5.1 基于信號(hào)增加策略的光電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)甲基轉(zhuǎn)移酶活性51
• 5.2 基于G-四連體和外切酶III的電化學(xué)方法檢測(cè)Dam甲基轉(zhuǎn)移酶活性51
• 5.3 基于全光射的光電生物傳感器檢測(cè)DNA羥甲基化51
• 5.4 基于電化學(xué)免疫傳感器定量分析乳腺癌細(xì)胞中的 5-hmC51-52
• 6 創(chuàng)新之處52-53
• 7 參考文獻(xiàn)53-62
• 8 致謝62-64
• 9 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文情況64

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前4條

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本文編號(hào)：670112