本文關鍵詞：木瓜蛋白酶過氧化物模擬酶性質及其分析應用

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【摘要】：自然界中的一切生命活動都有酶的參與,天然酶能在比較溫和的條件下高效、專一地催化生化反應。由于其催化效率高、專一性強和條件溫和等特點,使得酶催化在醫(yī)藥、農業(yè)和食品等領域得到廣泛的應用。但是,天然酶又存在易失活、價格昂貴等缺點,限制了其應用。為了克服天然酶的缺點,人們相繼開發(fā)了卟啉類模擬酶、主客體模擬酶、印跡高分子模擬酶、膜體系及配合物模擬酶等。由于具有表/界面效應、量子尺寸效應、小尺寸效應以及宏觀量子軌道效應等效應,納米材料具有優(yōu)良的性能,得到廣泛重視。然而,納米材料的催化模擬酶活性卻一直被人們忽視。自從2007年閻錫蘊小組發(fā)現(xiàn)四氧化三鐵納米粒子具有過氧化物模擬酶特性以后,納米模擬酶迅速成為研究熱點,研究者發(fā)現(xiàn)金屬氧化物納米材料、碳基納米材料、貴金屬納米材料等多種納米材料都具有過氧化物模擬酶活性。與天然酶相比,納米材料模擬酶具有催化活性高、穩(wěn)定性好、能耐受極端環(huán)境、重復利用率高等優(yōu)點。但其中部分納米材料的酶活性與其性質、組成、尺寸和表面修飾劑等有很大關系。很多納米材料易于團聚,表面需要修飾穩(wěn)定劑,而穩(wěn)定劑的引入又往往會降低模擬酶活性;很多納米材料還很難大批量,不同批次制備的同種納米材料模擬酶活性往往也有差別。因此,尋找新的過氧化物模擬酶仍有重要意義。我們發(fā)現(xiàn)木瓜蛋白酶具有過氧化物模擬酶性質,詳細研究了其催化機理和催化動力學;基于木瓜蛋白酶的過氧化物模擬酶活性,結合顯色反應,構建了檢測葡萄糖和谷胱甘肽的新方法。(1)本章發(fā)現(xiàn)木瓜蛋白酶具有過氧化物模擬酶催化活性,在H2O2存在下可以催化氧化底物3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、鄰苯二胺(OPD)、2,2’-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS),其催化活性與pH、溫度、過氧化氫濃度和孵育時間有關,優(yōu)化條件為pH 5.5,35℃,1 mM和2 h。穩(wěn)態(tài)動力學結果表明其催化行為符合典型的Michaelis-Menten動力學模型,其催化機理遵循乒乓機理。同時我們對于未知成分做了分析,電感耦合等離子體質譜結果表明其過氧化物模擬酶催化活性并不源于其內含的金屬雜質。與HRP孵育不同時間后測定其過氧化物模擬酶活性表明,過氧化物酶活性可能是來自一個未知的雜質。木瓜蛋白酶不僅有蛋白酶的功能,還具有類似過氧化物酶的功能。這為進一步認識酶的功能提供了新依據(jù)。(2)檢測過氧化氫(H2O2)在生物、醫(yī)學、環(huán)境保護和食品工業(yè)等許多領域都有著非常重要的意義。作為過氧化物模擬酶,木瓜蛋白酶可以催化TMB和H2O2的顯色反應,且最終產物的顏色、最大吸收波長處(652 nm)的吸光度與H2O2的濃度呈相關性,因此可以直接檢測過氧化氫的濃度。而葡萄糖在葡萄糖氧化酶(GOx)催化下可定量產生過氧化氫和葡萄糖酸,結合TMB-H2O2顯色反應,我們還建立了一種簡單、方便、靈敏和高選擇性比色法檢測葡萄糖的方法。(3)谷胱甘肽(GSH)廣泛存在于自然界,其巰基基團對細胞中還原性環(huán)境的維持具有重要作用。作為過氧化物模擬酶,木瓜蛋白酶能夠催化H2O2氧化TMB,產生的藍色物質在652 nm處有吸收峰。這一顯色反應中需要有陽離子自由基的參與,而還原性的GSH可以與陽離子自由基反應重新生成TMB,導致TMB氧化產物減少,藍色褪去,652 nm處的吸光度值降低�；诖�,我們設計一種新的比色傳感器用于谷胱甘肽檢測,線性范圍為0.1-10μM,檢測限為0.03μM。
【關鍵詞】：木瓜蛋白酶 過氧化物模擬酶 比色分析法
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：O657.3;O629.8
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 符號說明10-11
• 第一章 緒論11-25
• 1.1 納米材料模擬酶11-20
• 1.1.1 金屬氧化物納米材料11-15
• 1.1.2 碳基納米材料15-17
• 1.1.3 貴金屬納米材料17-19
• 1.1.4 其他納米材料19-20
• 1.2 影響納米材料的因素20-23
• 1.2.1 粒徑20
• 1.2.2 形貌20-21
• 1.2.3 表面修飾和包覆21-22
• 1.2.4 構成22
• 1.2.5 催化劑和抑制劑22-23
• 1.3 木瓜蛋白酶23
• 1.4 結論和展望23-25
• 第二章 木瓜蛋白酶過氧化物模擬酶性質研究25-35
• 2.1 引言25-26
• 2.2 實驗部分26-27
• 2.2.1 試劑與儀器26
• 2.2.2 順磁共振（EPR）實驗26
• 2.2.3 初速度的計算26-27
• 2.2.4 動力學實驗方法27
• 2.3 結果與討論27-34
• 2.3.1 木瓜蛋白酶的過氧化物模擬酶性質27-29
• 2.3.2 影響木瓜蛋白酶催化活性的因素29
• 2.3.3 木瓜蛋白酶穩(wěn)定性29-30
• 2.3.4 木瓜蛋白酶的催化動力學及催化機理30-32
• 2.3.5 催化機理32
• 2.3.6 催化活性來源32-34
• 2.4 本章小結34-35
• 第三章 基于木瓜蛋白酶過氧化物酶活性的葡萄糖檢測35-41
• 3.1 引言35-36
• 3.2 實驗部分36-37
• 3.2.1 試劑與儀器36-37
• 3.2.2 H_2O_2的檢測37
• 3.2.3 葡萄糖的測定37
• 3.2.4 血糖中葡萄糖的測定37
• 3.3 結果與討論37-40
• 3.3.1 木瓜蛋白酶的過氧化物模擬酶活性37-38
• 3.3.2 測定條件優(yōu)化38
• 3.3.3 過氧化氫和葡萄糖的檢測38-40
• 3.4 結論40-41
• 第四章 基于木瓜蛋白酶過氧化物模擬酶活性檢測谷胱甘肽41-47
• 4.1 引言41-42
• 4.2 實驗部分42-43
• 4.2.1 試劑與儀器42
• 4.2.2 GSH的檢測42-43
• 4.3 結果與討論43-46
• 4.3.1 GSH的自由基恢復能力43
• 4.3.2 測定GSH條件的優(yōu)化43-44
• 4.3.3 GSH檢測44-45
• 4.3.4 選擇性45-46
• 4.3.5 實際樣的應用46
• 4.4 結論46-47
• 第五章 全文總結與展望47-48
• 參考文獻48-62
• 碩士期間已發(fā)表和待發(fā)表的研究成果62-63
• 致謝63

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本文編號：657887