本文關(guān)鍵詞：木瓜蛋白酶過氧化物模擬酶性質(zhì)及其分析應(yīng)用

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【摘要】：自然界中的一切生命活動都有酶的參與,天然酶能在比較溫和的條件下高效、專一地催化生化反應(yīng)。由于其催化效率高、專一性強(qiáng)和條件溫和等特點,使得酶催化在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和食品等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。但是,天然酶又存在易失活、價格昂貴等缺點,限制了其應(yīng)用。為了克服天然酶的缺點,人們相繼開發(fā)了卟啉類模擬酶、主客體模擬酶、印跡高分子模擬酶、膜體系及配合物模擬酶等。由于具有表/界面效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)以及宏觀量子軌道效應(yīng)等效應(yīng),納米材料具有優(yōu)良的性能,得到廣泛重視。然而,納米材料的催化模擬酶活性卻一直被人們忽視。自從2007年閻錫蘊小組發(fā)現(xiàn)四氧化三鐵納米粒子具有過氧化物模擬酶特性以后,納米模擬酶迅速成為研究熱點,研究者發(fā)現(xiàn)金屬氧化物納米材料、碳基納米材料、貴金屬納米材料等多種納米材料都具有過氧化物模擬酶活性。與天然酶相比,納米材料模擬酶具有催化活性高、穩(wěn)定性好、能耐受極端環(huán)境、重復(fù)利用率高等優(yōu)點。但其中部分納米材料的酶活性與其性質(zhì)、組成、尺寸和表面修飾劑等有很大關(guān)系。很多納米材料易于團(tuán)聚,表面需要修飾穩(wěn)定劑,而穩(wěn)定劑的引入又往往會降低模擬酶活性;很多納米材料還很難大批量,不同批次制備的同種納米材料模擬酶活性往往也有差別。因此,尋找新的過氧化物模擬酶仍有重要意義。我們發(fā)現(xiàn)木瓜蛋白酶具有過氧化物模擬酶性質(zhì),詳細(xì)研究了其催化機(jī)理和催化動力學(xué);基于木瓜蛋白酶的過氧化物模擬酶活性,結(jié)合顯色反應(yīng),構(gòu)建了檢測葡萄糖和谷胱甘肽的新方法。(1)本章發(fā)現(xiàn)木瓜蛋白酶具有過氧化物模擬酶催化活性,在H2O2存在下可以催化氧化底物3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、鄰苯二胺(OPD)、2,2’-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS),其催化活性與pH、溫度、過氧化氫濃度和孵育時間有關(guān),優(yōu)化條件為pH 5.5,35℃,1 mM和2 h。穩(wěn)態(tài)動力學(xué)結(jié)果表明其催化行為符合典型的Michaelis-Menten動力學(xué)模型,其催化機(jī)理遵循乒乓機(jī)理。同時我們對于未知成分做了分析,電感耦合等離子體質(zhì)譜結(jié)果表明其過氧化物模擬酶催化活性并不源于其內(nèi)含的金屬雜質(zhì)。與HRP孵育不同時間后測定其過氧化物模擬酶活性表明,過氧化物酶活性可能是來自一個未知的雜質(zhì)。木瓜蛋白酶不僅有蛋白酶的功能,還具有類似過氧化物酶的功能。這為進(jìn)一步認(rèn)識酶的功能提供了新依據(jù)。(2)檢測過氧化氫(H2O2)在生物、醫(yī)學(xué)、環(huán)境保護(hù)和食品工業(yè)等許多領(lǐng)域都有著非常重要的意義。作為過氧化物模擬酶,木瓜蛋白酶可以催化TMB和H2O2的顯色反應(yīng),且最終產(chǎn)物的顏色、最大吸收波長處(652 nm)的吸光度與H2O2的濃度呈相關(guān)性,因此可以直接檢測過氧化氫的濃度。而葡萄糖在葡萄糖氧化酶(GOx)催化下可定量產(chǎn)生過氧化氫和葡萄糖酸,結(jié)合TMB-H2O2顯色反應(yīng),我們還建立了一種簡單、方便、靈敏和高選擇性比色法檢測葡萄糖的方法。(3)谷胱甘肽(GSH)廣泛存在于自然界,其巰基基團(tuán)對細(xì)胞中還原性環(huán)境的維持具有重要作用。作為過氧化物模擬酶,木瓜蛋白酶能夠催化H2O2氧化TMB,產(chǎn)生的藍(lán)色物質(zhì)在652 nm處有吸收峰。這一顯色反應(yīng)中需要有陽離子自由基的參與,而還原性的GSH可以與陽離子自由基反應(yīng)重新生成TMB,導(dǎo)致TMB氧化產(chǎn)物減少,藍(lán)色褪去,652 nm處的吸光度值降低。基于此,我們設(shè)計一種新的比色傳感器用于谷胱甘肽檢測,線性范圍為0.1-10μM,檢測限為0.03μM。
【關(guān)鍵詞】：木瓜蛋白酶 過氧化物模擬酶 比色分析法
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：O657.3;O629.8
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 符號說明10-11
• 第一章 緒論11-25
• 1.1 納米材料模擬酶11-20
• 1.1.1 金屬氧化物納米材料11-15
• 1.1.2 碳基納米材料15-17
• 1.1.3 貴金屬納米材料17-19
• 1.1.4 其他納米材料19-20
• 1.2 影響納米材料的因素20-23
• 1.2.1 粒徑20
• 1.2.2 形貌20-21
• 1.2.3 表面修飾和包覆21-22
• 1.2.4 構(gòu)成22
• 1.2.5 催化劑和抑制劑22-23
• 1.3 木瓜蛋白酶23
• 1.4 結(jié)論和展望23-25
• 第二章 木瓜蛋白酶過氧化物模擬酶性質(zhì)研究25-35
• 2.1 引言25-26
• 2.2 實驗部分26-27
• 2.2.1 試劑與儀器26
• 2.2.2 順磁共振（EPR）實驗26
• 2.2.3 初速度的計算26-27
• 2.2.4 動力學(xué)實驗方法27
• 2.3 結(jié)果與討論27-34
• 2.3.1 木瓜蛋白酶的過氧化物模擬酶性質(zhì)27-29
• 2.3.2 影響木瓜蛋白酶催化活性的因素29
• 2.3.3 木瓜蛋白酶穩(wěn)定性29-30
• 2.3.4 木瓜蛋白酶的催化動力學(xué)及催化機(jī)理30-32
• 2.3.5 催化機(jī)理32
• 2.3.6 催化活性來源32-34
• 2.4 本章小結(jié)34-35
• 第三章 基于木瓜蛋白酶過氧化物酶活性的葡萄糖檢測35-41
• 3.1 引言35-36
• 3.2 實驗部分36-37
• 3.2.1 試劑與儀器36-37
• 3.2.2 H_2O_2的檢測37
• 3.2.3 葡萄糖的測定37
• 3.2.4 血糖中葡萄糖的測定37
• 3.3 結(jié)果與討論37-40
• 3.3.1 木瓜蛋白酶的過氧化物模擬酶活性37-38
• 3.3.2 測定條件優(yōu)化38
• 3.3.3 過氧化氫和葡萄糖的檢測38-40
• 3.4 結(jié)論40-41
• 第四章 基于木瓜蛋白酶過氧化物模擬酶活性檢測谷胱甘肽41-47
• 4.1 引言41-42
• 4.2 實驗部分42-43
• 4.2.1 試劑與儀器42
• 4.2.2 GSH的檢測42-43
• 4.3 結(jié)果與討論43-46
• 4.3.1 GSH的自由基恢復(fù)能力43
• 4.3.2 測定GSH條件的優(yōu)化43-44
• 4.3.3 GSH檢測44-45
• 4.3.4 選擇性45-46
• 4.3.5 實際樣的應(yīng)用46
• 4.4 結(jié)論46-47
• 第五章 全文總結(jié)與展望47-48
• 參考文獻(xiàn)48-62
• 碩士期間已發(fā)表和待發(fā)表的研究成果62-63
• 致謝63

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本文編號：657887