本文關(guān)鍵詞：基于鏈替代信號(hào)放大技術(shù)靈敏檢測(cè)疾病相關(guān)靶分子的研究

  更多相關(guān)文章： 磷酸化 熒光 流式法 端粒酶RNA(hTR) 鏈替代信號(hào)放大

【摘要】：核酸和蛋白質(zhì)是組成生物體的兩種重要大分子物質(zhì),在生物體的生命活動(dòng)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。因此對(duì)于這兩類生物大分子的分析檢測(cè)已經(jīng)發(fā)展成為當(dāng)代生物分析化學(xué)的研究熱點(diǎn)。追求簡(jiǎn)單、靈敏、穩(wěn)定、特異性好的分析檢測(cè)方法是當(dāng)前研究的重點(diǎn)。目前基于核酸探針的信號(hào)放大技術(shù)大都是利用各種工具酶和納米材料進(jìn)行信號(hào)放大實(shí)現(xiàn)分析物的靈敏測(cè)定,但是在此過程中往往需要引入其他的輔助酶,費(fèi)用較高,同時(shí)需要嚴(yán)格控制酶的存儲(chǔ)以及操作條件。另外對(duì)于復(fù)雜體系中樣品測(cè)定,有較強(qiáng)的背景干擾,不利于測(cè)定。因此,如何建立新的抗干擾的生物信號(hào)放大檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)以及新的信號(hào)轉(zhuǎn)換方式,來更好的解決生物分子分析過程中存在的上述問題,仍是研究的熱點(diǎn)以及難點(diǎn)。本工作,基于無需酶輔助的鏈替代信號(hào)放大技術(shù),結(jié)合新的信號(hào)轉(zhuǎn)換方式和微磁球的表面固定化,構(gòu)建了一系列新方法用于蛋白質(zhì)以及核酸的靈敏測(cè)定。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果可歸納為以下兩個(gè)方面：一、基于雙重信號(hào)放大技術(shù)檢測(cè)T4多聚核苷酸激酶活性及抑制熒光法的研究基于鏈替代和環(huán)糊精增敏作用的雙重信號(hào)放大技術(shù),以對(duì)距離敏感的芘分子作為信號(hào)轉(zhuǎn)換元件,建立了一種均相、靈敏、快速檢測(cè)T4多聚核苷酸激酶(PNK)活性以及抑制的熒光法。以非標(biāo)記的發(fā)卡探針H1作為PNK的底物,單標(biāo)記的發(fā)卡探針H2、H3作為信號(hào)探針。在RNK、lambda核酸外切酶(λexo)存在時(shí),以磷酸化誘導(dǎo)的λexo切割作用所釋放的DNA作為鏈替代反應(yīng)的引發(fā)鏈,打開發(fā)卡探針H2。打開的探針H2接著打開探針H3,形成H2/H3雜交雙鏈的同時(shí)重新釋放出引發(fā)鏈,使得芘分子單體相互靠近,形成芘分子二聚體,體系熒光信號(hào)增強(qiáng),實(shí)現(xiàn)第一步信號(hào)放大。隨后加入γ-環(huán)糊精(γ-CD),由于γ-CD可以保護(hù)芘分子二聚體的熒光不受周圍環(huán)境干擾,同時(shí)可進(jìn)一步拉近二聚體分子間的距離,使得芘分子二聚體的熒光信號(hào)進(jìn)一步增強(qiáng),實(shí)現(xiàn)第二步信號(hào)放大�；谏鲜鲭p重信號(hào)放大技術(shù),PNK活性檢測(cè)的線性范圍為0.0005-5 U/mL,檢出限9.3×10-5U/mL。不同抑制劑對(duì)于PNK活性影響的研究表明該方法還可以用于抑制劑篩選。因此,該方法是一種簡(jiǎn)單、靈敏、快速的PNK活性檢測(cè)以及酶抑制劑研究的熒光法。二、基于鏈替代循環(huán)放大法靈敏檢測(cè)端粒酶RNA流式法的研究基于磁性微球(MB)的可控磁分離和鏈替代反應(yīng)信號(hào)放大作用,建立了-種簡(jiǎn)單、靈敏、抗干擾的檢測(cè)端粒酶RNA(hTR)的流式新方法。首先,將生物素化的發(fā)卡探針H1固定到鏈霉親和素化的磁性微球(MB)表面,通過磁分離除掉多余H1。當(dāng)目標(biāo)物不存在時(shí),發(fā)夾探針H1與H2在溶液中保持自身的發(fā)夾結(jié)構(gòu),鏈替代反應(yīng)無法發(fā)生,熒光標(biāo)記的H2探針不能富集到磁性微球(MB)表面。當(dāng)目標(biāo)hTR存在時(shí),hTR能夠打開探針H1,打開的探針H1可以與一端標(biāo)記羧基熒光素的探針H2發(fā)生鏈替代反應(yīng),在磁珠表面形成H1/H2的雜交雙鏈。替代下來的hTR循環(huán)引發(fā)鏈替代反應(yīng),使得熒光信號(hào)在磁性微球表面富集。通過該鏈替代信號(hào)放大作用,目標(biāo)物的檢測(cè)線性范圍為0.001 nM到1 nM,檢出限為0.0003nM。同時(shí)該方法還能區(qū)分單堿基突變。因此該方法是一種簡(jiǎn)單、快速、穩(wěn)定檢測(cè)端粒酶RNA的流式法。
【關(guān)鍵詞】：磷酸化 熒光 流式法 端粒酶RNA(hTR) 鏈替代信號(hào)放大
【學(xué)位授予單位】：陜西師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：O657.3
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 第1章 緒論10-34
• 1.1 核酸和蛋白質(zhì)檢測(cè)的意義10
• 1.2 基于核酸探針的核酸和蛋白質(zhì)的檢測(cè)10-17
• 1.2.1 基于核酸探針的電化學(xué)檢測(cè)途徑11-12
• 1.2.2 基于核酸探針的比色檢測(cè)途徑12-13
• 1.2.3 基于核酸探針的表面增強(qiáng)拉曼散射檢測(cè)途徑13-15
• 1.2.4 基于核酸探針的熒光檢測(cè)途徑15-16
• 1.2.5 基于核酸探針的流式檢測(cè)途徑16-17
• 1.3 核酸探針信號(hào)放大技術(shù)及其在生物分析檢測(cè)中的應(yīng)用17-31
• 1.3.1 工具酶輔助的信號(hào)放大18-24
• 1.3.2 基于DNA自組裝的信號(hào)放大24-27
• 1.3.3 基于納米材料的信號(hào)放大的信號(hào)放大27-30
• 1.3.4 基于微磁球的信號(hào)放大30-31
• 1.4 選題依據(jù)及研究?jī)?nèi)容31-34
• 第2章 基于雙重信號(hào)放大技術(shù)檢測(cè)T4多聚核苷酸激酶活性及抑制熒光法的研究34-50
• 2.1 引言34-35
• 2.2 實(shí)驗(yàn)部分35-37
• 2.2.1 試劑和儀器35-36
• 2.2.2 實(shí)驗(yàn)步驟36-37
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論37-48
• 2.3.1 實(shí)驗(yàn)原理及驗(yàn)證37-42
• 2.3.2 條件優(yōu)化42-44
• 2.3.3 選擇性考察44-45
• 2.3.4 靈敏度考察45-46
• 2.3.5 抑制劑考察46-48
• 2.4 小結(jié)48-50
• 第3章 基于鏈替代循環(huán)放大檢測(cè)端粒酶RNA流式法的研究50-64
• 3.1 引言50-51
• 3.2 實(shí)驗(yàn)部分51-53
• 3.2.1 試劑與儀器51-52
• 3.2.2 實(shí)驗(yàn)步驟52-53
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論53-62
• 3.3.1 實(shí)驗(yàn)原理及驗(yàn)證53-57
• 3.3.2 條件優(yōu)化57-58
• 3.3.3 方法靈敏度考察58-60
• 3.3.4 選擇性考察60-61
• 3.3.5 復(fù)雜體系中端粒酶RNA測(cè)定61-62
• 3.4 小結(jié)62-64
• 結(jié)論64-66
• 參考文獻(xiàn)66-78
• 致謝78-80
• 攻讀學(xué)位期間研究成果80

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