發(fā)布時(shí)間：2017-07-28 18:32

  本文關(guān)鍵詞：鳥嘌呤化學(xué)發(fā)光反應(yīng)研究及其分析應(yīng)用

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【摘要】：鳥嘌呤(G)與3,4,5-三甲氧基苯甲酰甲醛(TMPG)可特異性反應(yīng)產(chǎn)生瞬時(shí)化學(xué)發(fā)光。該化學(xué)發(fā)光體系簡(jiǎn)單、快速、且易與核酸識(shí)別相結(jié)合,在基于DNA識(shí)別的生物傳感中具有很好的優(yōu)勢(shì)。本研究以此化學(xué)發(fā)光體系為研究對(duì)象,建立了測(cè)定酶活性和離子的新方法。具體研究?jī)?nèi)容如下：一.鳥嘌呤化學(xué)發(fā)光反應(yīng)研究本工作中,我們對(duì)鳥嘌呤化學(xué)發(fā)光反應(yīng)進(jìn)行較系統(tǒng)地研究,探索了影響此化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的主要因素,詳細(xì)考察了含有G堿基的DNA的序列及其構(gòu)象對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響,優(yōu)化了反應(yīng)條件,并探討了鳥嘌呤化學(xué)發(fā)光與熒光分子間的共振能量轉(zhuǎn)移。此研究為鳥嘌呤化學(xué)發(fā)光在生物傳感中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。二.鳥嘌呤化學(xué)發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移體系檢測(cè)核酸外切酶Ⅰ的活性本工作中,設(shè)計(jì)了一個(gè)5'端標(biāo)有生物素、3'端標(biāo)有熒光素(FAM)的DNA探針PI(5'-biotin-AAA AAA AAA AGA GAG AGA GAG AGA GAG AG-FAM-3')。在沒有Exo I存在下,生物素與鏈霉親和素之間強(qiáng)烈的相互作用將DNA探針連接到用鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠上,加入TMPG后體系發(fā)生化學(xué)發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移產(chǎn)生強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光信號(hào)；核酸外切酶I(Exo I)存在下,Exo I從3’端開始將探針P1切割成單核苷酸。此切割作用使最終連接到磁珠上富G的DNA序列變短,產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度減小,同時(shí)把3'末端標(biāo)有FAM的G堿基單核苷酸切下后,TMPG-鳥嘌呤-FAM之間的化學(xué)發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移不能發(fā)生,使得體系產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度大大降低。根據(jù)體系中化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度變化,實(shí)現(xiàn)對(duì)Exo I活性的檢測(cè),檢出限為1.1×10-5U/μL該方法將鳥嘌呤化學(xué)發(fā)光體系引入酶活性檢測(cè)。結(jié)合磁珠的分離作用,該方法可望用于復(fù)雜樣品中Exo I活性的檢測(cè)。三.鳥嘌呤化學(xué)發(fā)光體系測(cè)定鉀離子本工作中,我們首先篩選出對(duì)鉀離子響應(yīng)最佳的富G的DNA探針AG4(5'-TGG GTA GGG CGG GTT GGG AAA-3')。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：在沒有鉀離子的存在下,探針AG4處于自由纏繞狀態(tài)可以與TMPG在四丁基氫氧化銨-磷酸緩沖(pH8.5)中產(chǎn)生強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光；在鉀離子存在下,鉀離子誘導(dǎo)探針AG4折疊成G-四聚體,加入TMPG后體系產(chǎn)生弱的化學(xué)發(fā)光。根據(jù)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的降低,實(shí)現(xiàn)對(duì)鉀離子的檢測(cè),檢出限為9μM。該方法最有良好的選擇性,鈉離子、鎂離子、鈣離子等不產(chǎn)生干擾,已初步用于對(duì)尿液中鉀離子含量的分析。此外,我們探討了形成G-四聚體結(jié)構(gòu)后化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度降低的原因。由于G-四聚體之間G堿基之間形成的氫鍵作用,占據(jù)了TMPG與G堿基的反應(yīng)位點(diǎn),且G-四聚體的類平面結(jié)構(gòu)使得TMPG與G堿基的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)受到阻礙,從而使體系的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度降低。四.鳥嘌呤化學(xué)共振能量轉(zhuǎn)移法檢測(cè)尿嘧啶-DNA糖基化酶活性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：富G單鏈DNA和G-四聚體化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度不同,而富G單鏈DNA和富G雙鏈DNA發(fā)光強(qiáng)度基本相同。利用此現(xiàn)象,建立了TMPG-鳥嘌呤-FAM的CRET法檢測(cè)尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)活性的方法。我們?cè)O(shè)計(jì)了一個(gè)雙鏈DNA探針,其中一條探針為標(biāo)記FAM且含有U堿基的富G的DNA序列,另一條為其互補(bǔ)序列。在沒有UDG酶存在下,標(biāo)記FAM的雙鏈DNA與TMPG發(fā)生化學(xué)發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移產(chǎn)生強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光信號(hào)。UDG酶存在下,UDG酶水解雙鏈DNA的U堿基,使得雙鏈DNA解離成單鏈。在鉀離子的誘導(dǎo)下,富G的DNA序列折疊形成G-四聚體,與TMPG反應(yīng)產(chǎn)生弱的化學(xué)發(fā)光信號(hào)。利用雙鏈DNA與G-四聚體化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度之間的差異檢測(cè)UDG酶的活性。該方法檢測(cè)簡(jiǎn)單快速,檢出限為0.3 U/mL。該方法用于檢測(cè)UDG酶的抑制劑UGI抑制能力的考察,并用于定性分析Hela細(xì)胞中UDG酶的活性。
【關(guān)鍵詞】：化學(xué)發(fā)光 鳥嘌呤 3 4 5-三甲氧基苯甲酰甲醛 核酸外切酶Ⅰ 尿嘧啶-DNA糖基化酶 鉀離子
【學(xué)位授予單位】：陜西師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：O657.3
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-9
• 第1章 綜述9-19
• 1.1 化學(xué)發(fā)光9-12
• 1.1.1 化學(xué)發(fā)光的簡(jiǎn)介9-10
• 1.1.2 化學(xué)發(fā)光體系分類10-12
• 1.2 鳥嘌呤瞬化學(xué)發(fā)光研究進(jìn)展12-17
• 1.3 本論文的選題目的及意義17-19
• 第2章 研究?jī)?nèi)容19-59
• 2.1 鳥嘌呤化學(xué)發(fā)光體系研究19-27
• 2.1.1 引言19
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)部分19-21
• 2.1.3 結(jié)果與討論21-25
• 2.1.4 小結(jié)25-27
• 2.2 鳥嘌呤化學(xué)發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移體系檢測(cè)核酸外切酶Ⅰ(Exo Ⅰ)的活性27-37
• 2.2.1 引言27-28
• 2.2.2 實(shí)驗(yàn)部分28-29
• 2.2.3 結(jié)果與討論29-36
• 2.2.4 小結(jié)36-37
• 2.3 鳥嘌呤化學(xué)發(fā)光體系測(cè)定鉀離子37-49
• 2.3.1 引言37-38
• 2.3.2 實(shí)驗(yàn)部分38-39
• 2.3.3 結(jié)果與討論39-47
• 2.3.4 小結(jié)47-49
• 2.4 鳥嘌呤化學(xué)共振能量轉(zhuǎn)移法檢測(cè)尿嘧啶-DNA糖基化酶活性49-59
• 2.4.1 引言49-50
• 2.4.2 實(shí)驗(yàn)部分50-51
• 2.4.3 結(jié)果與討論51-58
• 2.4.4 小結(jié)58-59
• 結(jié)論59-61
• 參考文獻(xiàn)61-67
• 致謝67-69
• 攻讀學(xué)位期間研究成果69

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