本文關(guān)鍵詞：重組腈水合酶NHaseK的功能表達(dá)及分子改造

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【摘要】：腈水合酶(EC 4.2.1.84)可催化2-(4-氯苯基)-3-甲基丁腈(CPIN)水合生成相應(yīng)的酰胺,用于合成高效殺蟲劑氰戊菊酯的重要前體戊菊酸。但目前報道的可轉(zhuǎn)化CPIN的腈水合酶數(shù)量較少且活性較低,極大地限制了催化效率。因此,對腈水合酶的重組表達(dá)及分子改造進(jìn)行研究,改善其催化活性具有重要意義。本文以實驗室前期獲得的對CPIN有高活性的腈水合酶NHaseK為研究對象,構(gòu)建了其在大腸桿菌中的功能表達(dá)體系。利用pETDuet-1具有雙T7啟動子的優(yōu)勢,將NHaseK功能表達(dá)必須具備的α亞基、β亞基和活化元件17k以八種不同的組合方式插入于兩個啟動子之下。當(dāng)將三段基因以基因簇形式共同插入于第一個啟動子之下時,亞基表達(dá)量均衡、活化元件充分表達(dá),酶活表現(xiàn)最佳,比活為0.78 U/mg蛋白。進(jìn)一步考察發(fā)現(xiàn),不同質(zhì)粒及SD序列對大腸桿菌表達(dá)NHaseK的影響不明顯�？紤]到p RSFDuet-1的卡那霉素抗性更適于發(fā)酵,確定以此為載體重組表達(dá)NHase K,粗酶活力為222.6 U/L。其次,采用同源建模和分子對接構(gòu)建NHaseK-CPIN復(fù)合物構(gòu)象,以此為基礎(chǔ)改造NHaseK。一方面,通過虛擬丙氨酸掃描篩選出10個突變熱點,根據(jù)它們的虛擬飽和突變結(jié)果選擇αG119進(jìn)行飽和突變實驗,但效果不佳；根據(jù)它們的丙氨酸突變實驗結(jié)果選擇βD49和αQ88進(jìn)行飽和突變,獲得14株正向突變子,其中βD49G活性最高,其比活為2.48 U/mg蛋白,是原始酶NHaseK的3.2倍。另一方面,選擇預(yù)測通道附近的大位阻殘基βF41進(jìn)行飽和突變,未能獲得正向突變子。進(jìn)一步對正向突變子進(jìn)行組合突變,未能獲得理想突變子。最后,考察βD49G及NHaseK的酶學(xué)性質(zhì)并初步探索催化CPIN工藝。發(fā)現(xiàn)βD49G的Kat增大4.4倍,是其活性提升的主要原因。此外p49G熱穩(wěn)定性也都有所提升,其在35℃、40℃、45℃的半衰期分別為114h、76 h、25 h,較原始酶NHaseK分別延長39%、72%、56%。初步探索重組菌E.coli/pRSFDuet-βD49G及E.coli/pRSFDuet-NHaseK催化工藝,確定它們的最適轉(zhuǎn)化條件均為40℃、pH6.5的Na2HPO4-檸檬酸緩沖體系、5%(v/v)甲醇作助溶劑。當(dāng)βD49G以0759 gDCW/L的細(xì)胞用量催化0.5 g/L CPIN時,在1h內(nèi)完成轉(zhuǎn)化,其效率是NHaseK的2倍。
【關(guān)鍵詞】：腈水合酶 CPIN 功能表達(dá) 半理性設(shè)計
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：O629.8
【目錄】：

• 致謝5-6
• 摘要6-7
• Abstract7-12
• 縮寫符號術(shù)語表12-13
• 第一章 綜述13-27
• 1.1 腈水合酶13-21
• 1.1.1 腈水合酶的來源與種類13-14
• 1.1.2 腈水合酶的基因序列特征14-15
• 1.1.3 腈水合酶的結(jié)構(gòu)特征15-16
• 1.1.4 腈水合酶的催化機(jī)理16-17
• 1.1.5 腈水合酶的重組表達(dá)及活化元件17-20
• 1.1.6 腈水合酶的應(yīng)用20-21
• 1.2 氰戊菊酯21-23
• 1.2.1 氰戊菊酯的簡介21-22
• 1.2.2 生物催化法制備氰戊菊酯前體戊菊酸22-23
• 1.3 酶的分子改造23-26
• 1.3.1 定向進(jìn)化23-24
• 1.3.2 理性設(shè)計24
• 1.3.3 半理性設(shè)計24-26
• 1.4 本課題的研究思路與主要內(nèi)容26-27
• 第二章 腈水合酶NHaseK在大腸桿菌中的功能表達(dá)27-49
• 2.1 引言27
• 2.2 材料與試劑27-29
• 2.2.1 實驗儀器27
• 2.2.2 質(zhì)粒與菌種27-28
• 2.2.3 藥品與試劑28
• 2.2.4 溶液與培養(yǎng)基的配制28-29
• 2.3 實驗方法29-36
• 2.3.1 質(zhì)粒的提取29
• 2.3.2 目的基因片段的擴(kuò)增29-31
• 2.3.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建31-32
• 2.3.4 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和驗證32
• 2.3.5 重組酶的誘導(dǎo)表達(dá)32
• 2.3.6 重組酶的純化32-33
• 2.3.7 SDS-PAGE33
• 2.3.8 蛋白濃度的測定33-34
• 2.3.9 底物與產(chǎn)物濃度的測定34-35
• 2.3.10 酶活的定義與測量35-36
• 2.4 結(jié)果與討論36-48
• 2.4.1 采用pETDuet-1實現(xiàn)NHaseK各亞基的平衡表達(dá)36-43
• 2.4.1.1 以pETDuet-1為載體的表達(dá)策略設(shè)計36-38
• 2.4.1.2 以pETDuet-1為載體的重組質(zhì)粒的構(gòu)建38-39
• 2.4.1.3 NHaseK以pETDuet-1為載體時的表達(dá)與活力39-42
• 2.4.1.4 重組酶的純化與最佳表達(dá)策略的確定42-43
• 2.4.2 質(zhì)�？截悢�(shù)對表達(dá)NHaseK的影響43-45
• 2.4.2.1 以不同質(zhì)粒為載體構(gòu)建NHaseK的重組質(zhì)粒43-44
• 2.4.2.2 NHaseK在不同質(zhì)粒中的表達(dá)與活力44-45
• 2.4.3 SD序列對表達(dá)NHaseK的影響45-48
• 2.4.3.1 SD序列的設(shè)計45
• 2.4.3.2 優(yōu)化NHaseK的SD序列45-47
• 2.4.3.3 SD優(yōu)化重組質(zhì)粒的表達(dá)47-48
• 2.5 本章小結(jié)48-49
• 第三章 腈水合酶NHaseK的半理性設(shè)計49-68
• 3.1 引言49
• 3.2 材料與試劑49-50
• 3.2.1 實驗儀器49
• 3.2.2 質(zhì)粒與菌株49
• 3.2.3 藥品與試劑49-50
• 3.2.4 溶液與培養(yǎng)基的配制50
• 3.3 實驗方法50-52
• 3.3.1 同源建模50
• 3.3.2 分子對接50
• 3.3.3 虛擬丙氨酸掃描50
• 3.3.4 虛擬定點飽和突變50
• 3.3.5 定點突變引物設(shè)計50-52
• 3.3.6 突變子的構(gòu)建52
• 3.3.7 突變酶的表達(dá)與純化52
• 3.3.8 突變酶的活力測定52
• 3.4 結(jié)果與討論52-67
• 3.4.1 腈水合酶NHaseK的同源建模52-55
• 3.4.2 NHaseK與底物CPIN的分子對接55-56
• 3.4.3 基于虛擬丙氨酸掃描的半理性設(shè)計56-65
• 3.4.3.1 NHaseK的虛擬丙氨酸掃描56-57
• 3.4.3.2 結(jié)合虛擬飽和突變的半理性設(shè)計57-60
• 3.4.3.3 結(jié)合丙氨酸突變實驗的半理性設(shè)計60-65
• 3.4.4 基于預(yù)測通道的半理性設(shè)計65-66
• 3.4.5 組合突變66-67
• 3.5 本章小結(jié)67-68
• 第四章 突變子βD49G與原始酶的酶學(xué)性質(zhì)及催化工藝對比68-83
• 4.1 引言68
• 4.2 材料與試劑68-69
• 4.2.1 實驗儀器68
• 4.2.2 質(zhì)粒與菌種68
• 4.2.3 藥品與試劑68-69
• 4.2.4 溶液與培養(yǎng)基的配制69
• 4.3 實驗方法69-72
• 4.3.1 酶學(xué)性質(zhì)研究69-70
• 4.3.1.1 溫度對重組酶的影響69
• 4.3.1.2 pH對重組酶影響69-70
• 4.3.1.3 重組酶的動力學(xué)參數(shù)70
• 4.3.2 催化工藝研究70-71
• 4.3.2.1 溫度對全細(xì)胞轉(zhuǎn)化CPIN的影響70
• 4.3.2.2 pH對全細(xì)胞轉(zhuǎn)化CPIN的影響70-71
• 4.3.2.3 助溶劑甲醇濃度對全細(xì)胞轉(zhuǎn)化CPIN的影響71
• 4.3.2.4 細(xì)胞量對轉(zhuǎn)化過程的影響71
• 4.3.3 細(xì)胞干重的測定71-72
• 4.4 結(jié)果與討論72-81
• 4.4.1 βD49G與NHaseK的酶學(xué)性質(zhì)對比72-77
• 4.4.1.1 溫度對βD49G與NHaseK的影響72-75
• 4.4.1.2 pH對βD49G與NHaseK的影響75-76
• 4.4.1.3 βD49G與NHaseK的動力學(xué)參數(shù)76-77
• 4.4.2 βD49G與NHaseK的全細(xì)胞催化工藝對比77-81
• 4.4.2.1 全細(xì)胞轉(zhuǎn)化溫度的確定77-78
• 4.4.2.2 全細(xì)胞轉(zhuǎn)化pH的確定78-79
• 4.4.2.3 助溶劑甲醇濃度的確定79-80
• 4.4.2.4 細(xì)胞量的確定80-81
• 4.5 本章小結(jié)81-83
• 第五章 結(jié)論與展望83-85
• 5.1 結(jié)論83-84
• 5.2 展望84-85
• 參考文獻(xiàn)85-92
• 附錄92
• 附錄Ⅰ 主要實驗儀器設(shè)備92-93
• 附錄Ⅱ 主要實驗試劑93-94
• 附錄Ⅲ 腈水合酶NHaseK基因序列94-95
• 附錄Ⅳ 質(zhì)粒圖譜95-98
• 作者簡介98

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前7條

1 馮旭東;李春;;酶的改造及其催化工程應(yīng)用[J];化學(xué)進(jìn)展;2015年11期

2 陳杰;賈旭;于慧敏;羅暉;沈忠耀;;耦合末端鹽橋與定點突變的重組腈水合酶催化動力學(xué)[J];化工學(xué)報;2014年07期

3 祝玲;周瓊;詹冰津;池麗影;張軍玲;;脂肪酶及酯酶定點突變研究進(jìn)展及其應(yīng)用[J];海峽藥學(xué);2012年02期

4 鄭裕國;薛亞平;柳志強(qiáng);鄭仁朝;沈寅初;;腈轉(zhuǎn)化酶在精細(xì)化學(xué)品生產(chǎn)中的應(yīng)用[J];生物工程學(xué)報;2009年12期

5 秦姣;微生物法生產(chǎn)丙烯酰胺的研究進(jìn)展[J];山東化工;2005年01期

6 蔣木庚,邢月華,王鳴華,馮仁杏,于康平;高效立體選擇性戊菊酯和氰戊菊酯的合成[J];南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報;1990年04期

7 曹廣宏;氰戊菊酯的合成、加工與應(yīng)用[J];農(nóng)藥;1990年02期

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 郭法謀;功能表達(dá)來源于Klebsiella oxytoca KCTC 1686的腈水合酶和酰胺酶及其應(yīng)用[D];浙江大學(xué);2016年

2 裴曉林;腈水合酶基因資源開發(fā)及其重組表達(dá)體系在制備煙酰胺中的應(yīng)用[D];浙江大學(xué);2013年

3 郁凱;以計算機(jī)輔助分子設(shè)計方法改造谷氨酸脫羧酶的研究[D];浙江大學(xué);2013年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 白天江;腈水合酶產(chǎn)生菌的培養(yǎng)條件及丙烯酰胺晶體的制備[D];哈爾濱理工大學(xué);2012年

2 褚華東;氰戊菊酯的手性拆分及其對映體的水生毒理學(xué)研究[D];浙江大學(xué);2006年

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本文編號：558994