本文關(guān)鍵詞：免疫磁珠—實(shí)時(shí)熒光PCR聯(lián)用技術(shù)快速檢測食品中單增李斯特菌的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：食品安全是食品中有毒有害物質(zhì)對(duì)于人體健康影響的重大公共衛(wèi)生問題。食源性致病菌是引起食品安全的最主要的來源。其中單增李斯特菌是一種極其常見的致病菌,可引起腦炎、腦膜炎、敗血癥、膿腫及孕婦流產(chǎn)等一系列食源性李斯特菌病,病死率較高,可達(dá)30%-70%。目前傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)方法存在費(fèi)時(shí)耗力等缺點(diǎn),常規(guī)PCR方法有前處理時(shí)間長、易污染實(shí)驗(yàn)室環(huán)境等缺點(diǎn)。因此,建立食品中單增李斯特菌的快速、準(zhǔn)確、可靠的檢測方法具有非常重要的實(shí)際意義和應(yīng)用價(jià)值。 本研究應(yīng)用免疫磁珠分離技術(shù),從污染菌很少的樣品中快速富集單增李斯特菌,以集菌方法代替增菌培養(yǎng),結(jié)合實(shí)時(shí)熒光PCR檢測,提高單增李斯特菌的檢出率,縮短檢驗(yàn)時(shí)間,提高檢測效率。 本實(shí)驗(yàn)通過比較EDC/NHS濃度、活化時(shí)間、抗體濃度、偶聯(lián)時(shí)間和偶聯(lián)溫度等條件對(duì)免疫磁珠捕獲單增李斯特菌效率的影響,確定免疫磁珠制備的具體流程：將磁珠用PBST (pH=6.0)清洗,加入475μLPBST (pH=7.4)和25μL1mg/mL抗體,室溫下孵育2h后,分離,并封閉。再通過比較檢測過程中免疫磁珠用量、富集時(shí)間和洗滌液pH,確定最佳條件：將100μ L的免疫磁珠加至100μ L的菌液中,在28℃、180rpm恒溫?fù)u床中孵育1h后,置于磁力架上進(jìn)行分離,棄去上清液,用500μL PBS(pH=7.4)重復(fù)洗滌3次,最后用50μL PBS (pH=7.4)重懸,用于下一步實(shí)驗(yàn)。將免疫磁珠富集分離的單增李斯特菌提取DNA模板后,用實(shí)時(shí)熒光PCR檢測,檢測條件經(jīng)優(yōu)化后選擇：PCR反應(yīng)體系：Premix Taq:12.5μL, ROX reference Dye:0.5μL,上游引物(10pmol/mL):1μL,下游引物(10pmol/mL):1μL, Taqman探針(10pmol/mL):1μL,雙蒸水：4μ L,DNA模板：5μ L,總體積為25μ L。PCR溫度設(shè)置：第一階段：95℃,2min;第二階段：95℃,5s,60℃,35s,進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。 本方法可以實(shí)現(xiàn)102～106CFU/mL檢測范圍內(nèi)線性相關(guān)度良好,最低檢測限為80CFU/mL。應(yīng)用于四大類九種食品：水產(chǎn)(海魚、蝦仁),肉類(生豬肉、香腸),蔬菜(生菜、黃瓜、番茄),奶類(牛奶、奶酪),實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明IMBS-real time PCR法可以快速實(shí)現(xiàn)定量檢測,且特異性和靈敏性較高,與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法相比,可以有效縮短檢測周期,提高檢測效率。
【關(guān)鍵詞】：食品安全 單增李斯特菌 免疫磁珠 實(shí)時(shí)熒光 PCR
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：O657.3;TS201.6
【目錄】：

• 致謝7-8
• 摘要8-9
• ABSTRACT9-11
• 目錄11-14
• 插圖和附表清單14-15
• 第一章 緒論15-31
• 1.1 研究背景15-25
• 1.1.1 食品安全問題現(xiàn)狀15-17
• 1.1.2 單增李斯特菌在食品中的存在現(xiàn)狀17-18
• 1.1.3 食源性致病菌的檢測技術(shù)18-21
• 1.1.4 實(shí)時(shí)熒光PCR原理及其優(yōu)點(diǎn)21-22
• 1.1.5 樣品前處理22-23
• 1.1.6 免疫磁珠分離技術(shù)及其原理23-25
• 1.2 研究現(xiàn)狀25-27
• 1.2.1 國外對(duì)病原微生物檢測的研究現(xiàn)狀25-26
• 1.2.2 國內(nèi)對(duì)病原微生物檢測的研究現(xiàn)狀26-27
• 1.3 研究目的與意義27-28
• 1.4 主要研究內(nèi)容及方法28-29
• 1.4.1 主要研究內(nèi)容28
• 1.4.2 技術(shù)路線圖28-29
• 1.5 本論文的組織架構(gòu)29-30
• 1.6 本章小結(jié)30-31
• 第二章 實(shí)驗(yàn)材料與方法31-39
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料31-32
• 2.1.1 菌種31
• 2.1.2 試劑31
• 2.1.3 實(shí)際樣品31
• 2.1.4 主要溶液配制31-32
• 2.1.5 主要儀器與設(shè)備32
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法32-38
• 2.2.1 免疫磁珠的制備32-35
• 2.2.1.1 磁珠活化33
• 2.2.1.1.1 EDC/NHS濃度33
• 2.2.1.1.2 EDC/NHS活化時(shí)間33
• 2.2.1.2 抗體偶聯(lián)33-34
• 2.2.1.2.1 最佳抗體濃度的選擇34
• 2.2.1.2.2 最佳偶聯(lián)時(shí)間的選擇34
• 2.2.1.2.3 最佳偶聯(lián)溫度的選擇34
• 2.2.1.3 封閉與保存34-35
• 2.2.2 免疫磁珠捕捉單增李斯特菌的方法建立及條件優(yōu)化35-36
• 2.2.2.1 最佳用量35
• 2.2.2.2 最佳富集時(shí)間35
• 2.2.2.3 洗滌液的最佳pH值35-36
• 2.2.3 DNA模板的提取36
• 2.2.4 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測36-37
• 2.2.4.1 引物與探針的設(shè)計(jì)與合成36
• 2.2.4.2 引物濃度優(yōu)化36
• 2.2.4.4 探針濃度優(yōu)化36-37
• 2.2.4.5 延伸溫度優(yōu)化37
• 2.2.5 實(shí)際樣品檢測37
• 2.2.5.1 樣品采集37
• 2.2.5.2 樣品中單增李斯特菌富集與檢測37
• 2.2.6 平板計(jì)數(shù)法37-38
• 2.3 本章小結(jié)38-39
• 第三章 免疫磁珠的制備與單增李斯特菌捕獲39-48
• 3.1 抗體純化39
• 3.2 免疫磁珠制備條件的優(yōu)化39-44
• 3.2.1 EDC/NHS濃度優(yōu)化39-40
• 3.2.2 EDC/NHS活化時(shí)間優(yōu)化40-41
• 3.2.3 抗體濃度優(yōu)化41-42
• 3.2.4 抗體偶聯(lián)時(shí)間優(yōu)化42-43
• 3.2.5 抗體偶聯(lián)溫度優(yōu)化43-44
• 3.3 免疫磁珠捕獲單增李斯特菌最佳條件的選擇44-47
• 3.3.1 免疫磁珠最佳用量的探索44-45
• 3.3.2 免疫磁珠最佳富集時(shí)間的探索45-46
• 3.3.3 洗滌液最佳pH的探索46-47
• 3.4 本章小結(jié)47-48
• 第四章 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法建立48-54
• 4.1 DNA模板提取48
• 4.2 引物與探針設(shè)計(jì)48
• 4.3 實(shí)時(shí)熒光PCR條件優(yōu)化48-51
• 4.3.1 引物濃度優(yōu)化48-49
• 4.3.2 探針濃度優(yōu)化49-50
• 4.3.3 延伸溫度優(yōu)化50-51
• 4.4 實(shí)時(shí)熒光PCR的特異性評(píng)價(jià)51
• 4.5 實(shí)時(shí)熒光PCR的靈敏性檢測51-52
• 4.6 實(shí)時(shí)熒光PCR的重復(fù)性檢測52-53
• 4.7 本章小結(jié)53-54
• 第五章 IMBS-real time PCR法檢測食品中的單增李斯特菌54-61
• 5.1 樣品前處理54
• 5.1.1 樣品采集54
• 5.1.2 人工染菌54
• 5.2 免疫磁珠富集分離54-55
• 5.3 實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測55
• 5.4 聯(lián)用技術(shù)效果評(píng)價(jià)55-60
• 5.4.1 食品中單增李斯特菌捕捉效率分析55-57
• 5.4.2 IMBS-real time PCR法的抗干擾性能評(píng)價(jià)57-58
• 5.4.3 IMBS-real time PCR法的穩(wěn)定性分析58
• 5.4.4 樣品定量檢測58-59
• 5.4.5 市售食品中單增李斯特菌的污染情況59
• 5.4.6 與國內(nèi)同類方法的比較59-60
• 5.5 本章小結(jié)60-61
• 第六章 總結(jié)與展望61-62
• 6.1 論文總結(jié)61
• 6.2 展望61-62
• 參考文獻(xiàn)62-68
• 作者筒介及碩士期間的主要科研成果68

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：免疫磁珠—實(shí)時(shí)熒光PCR聯(lián)用技術(shù)快速檢測食品中單增李斯特菌的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：438736