發(fā)布時(shí)間：2017-05-24 09:02

  本文關(guān)鍵詞：牛奶中三聚氰胺的ELISA和可視化納米金快速檢測(cè)技術(shù)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：食品安全直接關(guān)系到人類(lèi)的健康和生命安全，是關(guān)乎國(guó)計(jì)民生的大事，是當(dāng)今全世界共同關(guān)注的重大問(wèn)題。我國(guó)食品安全問(wèn)題正面臨著嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，尤其是乳制品行業(yè)。2008年發(fā)生的三鹿奶粉違法添加三聚氰胺事件，使得食品安全問(wèn)題再次成為全民關(guān)注的焦點(diǎn)。為解決現(xiàn)有常規(guī)檢測(cè)技術(shù)難以滿足現(xiàn)場(chǎng)和快速檢測(cè)需要的缺陷，研究建立快速、簡(jiǎn)便的三聚氰胺檢測(cè)方法對(duì)保證乳制品的質(zhì)量安全，維護(hù)人民的身體健康和消費(fèi)者的合法權(quán)益，促進(jìn)奶制品行業(yè)的健康發(fā)展均具有十分重要的社會(huì)意義和應(yīng)用價(jià)值。本研究以三聚氰胺為靶標(biāo)物，分別基于免疫學(xué)原理與納米金顯色技術(shù)設(shè)計(jì)建立兩種快速檢測(cè)方法。 1.三聚氰胺半抗原的改造及鑒定，完全抗原的合成及鑒定 首先對(duì)三聚氰胺半抗原進(jìn)行改造，選用三聚氰胺的衍生物（2-氯-4,6-二氨-1,3,5-三嗪）對(duì)其進(jìn)行羧基化修飾，用3-巰基丙酸取代三聚氰胺結(jié)構(gòu)上的氯原子，并對(duì)改造后的羧基化三聚氰胺進(jìn)行核磁共振-氫譜、碳譜及質(zhì)譜鑒定。通過(guò)活性酯法將羧基化三聚氰胺與載體蛋白BSA、OVA分別進(jìn)行偶聯(lián)，合成三聚氰胺完全抗原（MEL-BSA、MEL-OVA）。對(duì)獲得的完全抗原進(jìn)行SDS-PAGE及質(zhì)譜鑒定，表明三聚氰胺完全抗原制備成功。 2.三聚氰胺多抗制備及ELISA研究方法的初步建立 用獲得的完全抗原進(jìn)行實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫，采用MEL-BSA與等量弗氏佐劑(FA)混合，小劑量中程免疫的方法免疫6周齡雌性Balb/C小鼠，免疫間隔時(shí)間為兩周，免疫小鼠分A、B兩組各6只，不同劑量同步免疫。每次免疫后斷尾采血，間接ELISA測(cè)定抗血清的效價(jià)，結(jié)果顯示四免后B組抗血清效價(jià)均達(dá)到或高于1:20000，且抗血清對(duì)目標(biāo)小分子具有較高特異性和親和力。隨后對(duì)B組小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫，并于免疫7天后眼眶采血，經(jīng)免疫親和層析柱純化后得到多克隆抗體。建立針對(duì)三聚氰胺的間接ELISA分析方法，測(cè)得其回歸方程為：Y=-46.8376+27.4957X，R2為0.9938，經(jīng)計(jì)算得出其靈敏度（IC50）值為3.33mg/kg，最低檢出限（LOD）為0.117mg/kg，檢測(cè)區(qū)間在0.270～41.02mg/kg。通過(guò)與三嗪類(lèi)及結(jié)構(gòu)功能類(lèi)似物的交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證所制備的抗體具有較好的特異性。精密度實(shí)驗(yàn)表明該方法的重復(fù)性較好，為ELISA檢測(cè)方法的建立奠定了基礎(chǔ)。 3.基于納米金探針快速可視化檢測(cè)牛奶中三聚氰胺的方法研究 本實(shí)驗(yàn)以納米金顆粒(gold nanoparticles，Au NPs)為探針，研究建立了一種高效、可靠、低成本的比色檢測(cè)牛奶中三聚氰胺的方法，并基于此方法設(shè)計(jì)研發(fā)了三聚氰胺快速檢測(cè)試劑盒。其原理是由于三聚氰胺可通過(guò)氫鍵作用快速誘導(dǎo)納米金聚集，從而引起納米金光學(xué)性質(zhì)改變，表現(xiàn)為隨著三聚氰胺濃度增大，納米金溶液顏色由酒紅色向藍(lán)紫色變化，從而反映受檢樣品中三聚氰胺的濃度。本實(shí)驗(yàn)用硼氫化鈉法及檸檬酸鈉法制備不同粒徑的Au NPs，并通過(guò)肉眼、可見(jiàn)光譜及透射電鏡法對(duì)其進(jìn)行表征。隨后考察了納米金檢測(cè)方法的靈敏度、穩(wěn)定性及聚集動(dòng)力學(xué)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，5nm粒徑的Au NPs最適合作為檢測(cè)探針。在此基礎(chǔ)上，對(duì)納米金探針的各方面性能進(jìn)行了測(cè)試，結(jié)果表明納米金探針具有較好的選擇性和抗干擾能力；同時(shí)對(duì)樣品的前處理方法進(jìn)行優(yōu)化，不僅可以滿足納米金對(duì)三聚氰胺快速檢測(cè)的要求，而且也可以達(dá)到簡(jiǎn)化操作過(guò)程提高檢測(cè)效率的目的。從而建立了基于Au NPs的快速可視化檢測(cè)牛奶中三聚氰胺的方法。 4.基于納米金探針快速可視化檢測(cè)牛奶中三聚氰胺的試劑盒研發(fā) 實(shí)驗(yàn)方法建立后，，以Au NPs為探針設(shè)計(jì)研發(fā)了三聚氰胺比色檢測(cè)試劑盒。本實(shí)驗(yàn)首先是用硼氫化鈉法制備5nm粒徑的Au NPs，并制作標(biāo)準(zhǔn)比色卡，該標(biāo)準(zhǔn)比色卡是通過(guò)一系列含有不同濃度的MEL牛奶標(biāo)樣與5nm的Au NPs顯色反應(yīng)后的色差制備。該方法在一定程度上克服了傳統(tǒng)檢測(cè)中存在的問(wèn)題，比現(xiàn)有方法簡(jiǎn)便易行，反應(yīng)迅速，無(wú)需儀器，在室溫條件下，從樣品預(yù)處理到結(jié)果檢出只需10min，通過(guò)肉眼判別比色卡實(shí)現(xiàn)了對(duì)牛奶中三聚氰胺的定性和半定量化檢測(cè)，其檢測(cè)范圍是1~120mg/L，其檢出限已達(dá)到了國(guó)標(biāo)要求。當(dāng)與紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)聯(lián)用時(shí)，最大吸收峰發(fā)生紅移，在三聚氰胺濃度為0.2~20mg/L之間時(shí)表現(xiàn)了很好的線性關(guān)系，其檢出限可達(dá)0.2mg/L；同時(shí)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該試劑盒在室溫下有效期可達(dá)一年；通過(guò)與高效液相色譜/質(zhì)譜法（HPLC-MS）的比對(duì)實(shí)驗(yàn)分析，其檢測(cè)結(jié)果接近。因此，本研究成功建立了用于現(xiàn)場(chǎng)快速篩查和定性、半定量檢測(cè)液體奶、嬰兒配方奶粉和其它奶制品中三聚氰胺的方法，并研發(fā)了具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的國(guó)產(chǎn)化三聚氰胺檢測(cè)試劑盒。
【關(guān)鍵詞】：三聚氰胺 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 納米金顆粒 可視化 試劑盒
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：TS252.7;O652
【目錄】：

• 縮略詞表8-10
• 摘要10-12
• Abstract12-15
• 前言15-26
• 1 概述15-18
• 1.1 三聚氰胺檢測(cè)概述15-18
• 1.1.1 理化性質(zhì)15-16
• 1.1.2 毒副作用16
• 1.1.3 食品安全事件16-17
• 1.1.4 三聚氰胺限量標(biāo)準(zhǔn)17
• 1.1.5 檢測(cè)方法17-18
• 2、主要研究思路和方法18-25
• 2.1 生物檢測(cè)法18-22
• 2.1.1 研究技術(shù)路線18-19
• 2.1.2 主要研究方法19-22
• 2.2 納米金檢測(cè)法22-25
• 2.2.1 研究技術(shù)路線22-23
• 2.2.2 主要研究方法23-25
• 3 研究目的和意義25-26
• 第一章 三聚氰胺半抗原的改造及鑒定，完全抗原的合成及鑒定26-39
• 1 材料26-29
• 1.1 主要試劑26
• 1.2 主要儀器及耗材26-27
• 1.3 主要溶液的配制27-29
• 1.3.1 抗原制備相關(guān)溶液的配制27
• 1.3.2 SDS-PAGE 相關(guān)溶液的配制27-29
• 2 方法29-32
• 2.1 三聚氰胺半抗原的改造29-30
• 2.2 三聚氰胺完全抗原的制備30
• 2.3 三聚氰胺完全抗原的鑒定30-32
• 2.3.1 SDS-PAGE 法分析30-32
• 2.3.2 質(zhì)譜分析32
• 3 結(jié)果與分析32-38
• 3.1 三聚氰胺半抗原的鑒定32-36
• 3.1.1 核磁共振氫譜分析32-34
• 3.1.2 核磁共振碳譜分析34-35
• 3.1.3 質(zhì)譜分析35-36
• 3.2 三聚氰胺完全抗原的鑒定36-38
• 3.2.1 SDS-PAGE 分析36-37
• 3.2.2 質(zhì)譜分析37-38
• 4 討論38-39
• 第二章 抗 MEL 多抗的制備及其 ELISA 研究方法的初步建立39-52
• 1 材料39-41
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物39
• 1.2 主要試劑39
• 1.3 主要儀器及耗材39-40
• 1.4 主要溶液的配制40-41
• 1.4.1 多抗制備相關(guān)溶液的配制40
• 1.4.2 ELISA 相關(guān)溶液的配制40-41
• 2 方法41-46
• 2.1 抗 MEL 抗體的制備與鑒定41-43
• 2.1.1 動(dòng)物免疫41-42
• 2.1.1.1 免疫設(shè)計(jì)41
• 2.1.1.2 免疫方案41-42
• 2.1.1.3 免疫乳化劑的制備42
• 2.1.1.4 動(dòng)物采血42
• 2.1.2 抗血清效價(jià)測(cè)定42-43
• 2.1.3 抗血清特異性測(cè)定43
• 2.2 抗血清的鑒定43-44
• 2.3 抗血清的收集與保存44
• 2.4 ELISA 方法的研究建立44-46
• 2.4.1 最佳抗體濃度與包被濃度的確定44
• 2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制44-45
• 2.4.3 方法特異性試驗(yàn)45
• 2.4.4 方法精密度試驗(yàn)45-46
• 3 結(jié)果與討論46-51
• 3.1 抗血清的性質(zhì)鑒定46-48
• 3.1.1 抗血清效價(jià)測(cè)定46-47
• 3.1.2 抗血清特異性測(cè)定47-48
• 3.2 ELISA 研究方法的建立48-51
• 3.2.1 最佳包被濃度與抗體濃度的確定48-49
• 3.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制49
• 3.2.3 方法特異性試驗(yàn)49-51
• 3.2.4 方法精密度試驗(yàn)51
• 4 小結(jié)與討論51-52
• 第三章 基于納米金探針快速可視化檢測(cè)牛奶中三聚氰胺的方法研究52-69
• 1 材料52-53
• 1.1 主要試劑52
• 1.2 主要儀器及耗材52-53
• 1.3 主要溶液的配制53
• 2 方法53-56
• 2.1 納米金的制備53-54
• 2.1.1 制備不同粒徑的納米金53-54
• 2.1.2 納米金制備的注意事項(xiàng)54
• 2.2 納米金的表征54-55
• 2.3 納米金在實(shí)際樣品中檢測(cè)應(yīng)用55-56
• 2.3.1 樣品前處理55-56
• 2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)比色卡的制作56
• 2.3.3 實(shí)際樣品檢測(cè)56
• 3 結(jié)果與分析56-67
• 3.1 納米金的制備56-59
• 3.1.1 還原劑種類(lèi)及加入量對(duì)納米金制備的影響56-58
• 3.1.2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)納米金制備的影響58-59
• 3.1.3 攪拌方式及強(qiáng)度對(duì)納米金制備的影響59
• 3.2 納米金的表征59-61
• 3.3 納米金的粒徑選擇61-63
• 3.3.1 納米金的靈敏度61-62
• 3.3.2 納米金的穩(wěn)定性62-63
• 3.3.3 納米金的聚集動(dòng)力學(xué)63
• 3.4 類(lèi)似物的選擇性63-64
• 3.5 納米金的抗干擾能力64-65
• 3.6 樣品前處理優(yōu)化65
• 3.7 最低檢出限和檢測(cè)區(qū)間的確定65-66
• 3.8 與紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)聯(lián)用定量檢測(cè)三聚氰胺66-67
• 4 結(jié)論67-69
• 第四章 基于納米金探針快速可視化檢測(cè)牛奶中三聚氰胺的試劑盒研發(fā)69-77
• 1 材料69-70
• 1.1 主要試劑69
• 1.2 主要儀器及耗材69-70
• 1.3 主要溶液的配制70
• 2.方法70-72
• 2.1 制備 5nm 粒徑的納米金70
• 2.2 納米金的表征70
• 2.3 乳制品樣品前處理70-71
• 2.4 試劑盒穩(wěn)定性測(cè)試71
• 2.5 樣品測(cè)定方法71
• 2.6 加標(biāo)回收及比對(duì)實(shí)驗(yàn)71
• 2.7 三聚氰胺快速檢測(cè)試劑盒的構(gòu)造71-72
• 3 結(jié)果與分析72-76
• 3.1 納米金的表征72-73
• 3.2 試劑盒的穩(wěn)定性73-74
• 3.3 實(shí)際樣品前處理74
• 3.4 納米金探針在實(shí)物中的應(yīng)用74-75
• 3.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)75-76
• 4 結(jié)論76-77
• 結(jié)論與展望77-79
• 參考文獻(xiàn)79-84
• 文獻(xiàn)綜述84-92
• 參考文獻(xiàn)90-92
• 在學(xué)期間發(fā)表文章92
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷92-94
• 致謝94

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：390291