本文主要研究雙特異性抗體在免疫發(fā)光分析方法學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。利用蘇丹紅I作為模式分析物,分別采用異源雙功能交聯(lián)劑化學(xué)偶聯(lián)法和雜交-雜交瘤細(xì)胞融合方法構(gòu)建了兩種抗蘇丹紅I/抗發(fā)光底物的雙特異性抗體,利用構(gòu)建的抗體可以同時(shí)特異性地與發(fā)光底物和蘇丹紅Ⅰ的結(jié)合特性,建立了基于該雙特異性抗體的免疫發(fā)光分析方法。1.異源雙功能交聯(lián)劑化學(xué)偶聯(lián)法構(gòu)建雙特異性抗體采用二硫蘇糖醇(DTT)還原抗體重鏈與重鏈之間的二硫鍵形成游離的巰基,采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法優(yōu)化反應(yīng)條件,由實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出:反應(yīng)pH對(duì)重鏈與輕鏈(HC-LC)的產(chǎn)率影響最為顯著,其次是溫度和濃度,反應(yīng)時(shí)間的影響次之。最優(yōu)反應(yīng)條件如下:pH為7⁸之間,濃度為1mg/mL,溫度為25℃,時(shí)間2h,投料摩爾比例n(DTT):n(IgG)為30⁷0。利用異源雙功能交聯(lián)劑4-(N-馬來(lái)酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯鈉鹽(Sulfo-SMCC)先連接抗吖啶酯的單克隆抗體,后與還原二硫鍵的抗蘇丹紅I抗體進(jìn)行偶聯(lián),經(jīng)非還原SDS-PAGE檢測(cè),雙特異性抗體偶聯(lián)成功。2.雜交-雜交瘤細(xì)胞融合方法構(gòu)建雙特異性抗體采...

【文章頁(yè)數(shù)】：85 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第1章 緒論
    1.1 免疫發(fā)光分析方法
        1.1.1 酶聯(lián)免疫發(fā)光分析方法
        1.1.2 化學(xué)標(biāo)記免疫發(fā)光分析方法
    1.2 雙特異性抗體構(gòu)建的方法
        1.2.1 化學(xué)偶聯(lián)方法
        1.2.2 基因重組方法
        1.2.3 細(xì)胞融合方法
    1.3 雙特異性抗體應(yīng)用
        1.3.1 雙特異性抗體在醫(yī)藥學(xué)中的應(yīng)用
        1.3.2 雙特異性抗體在免疫學(xué)檢測(cè)中的應(yīng)用
    1.4 雙特異性抗體的純化
    1.5 本文的研究目的和主要內(nèi)容
第2章 化學(xué)偶聯(lián)法構(gòu)建雙特異性抗體的研究
    2.1 設(shè)備與材料
        2.1.1 主要試劑
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)所用溶液配制
        2.1.3 主要儀器
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法與過(guò)程
        2.2.1 抗 Sudan I 抗體與抗吖啶酯抗體的純化
            2.2.1.1 辛酸-硫酸銨法提純抗體
            2.2.1.2 Protein G免疫親和柱純化抗體
            2.2.1.3 抗Sudan Ⅰ和抗吖啶酯單克隆抗體的純度檢測(cè)
            2.2.1.4 抗Sudan Ⅰ和抗吖啶酯單克隆抗體的活性檢測(cè)
        2.2.2 DTT還原二硫鍵的最佳條件研究
            2.2.2.1 還原反應(yīng)條件的正交試驗(yàn)
            2.2.2.2 抗體與DTT的反應(yīng)摩爾比的優(yōu)化
            2.2.2.3 ELISA檢測(cè)還原二硫鍵后的抗體活性
        2.2.3 雙特異性抗體的化學(xué)偶聯(lián)
            2.2.3.1 Sulfo-SMCC與抗吖啶酯抗體的反應(yīng)摩爾比例優(yōu)化
            2.2.3.2 抗蘇丹紅/吖啶酯的雙特異性抗體的制備
        2.2.4 SDS-PAGE凝膠電泳鑒定雙特異性抗體
        2.2.5 化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)雙特異性抗體
            2.2.5.1 偶聯(lián)吖啶酯發(fā)光底物的準(zhǔn)備
            2.2.5.2 雙特異性抗體發(fā)光檢測(cè)
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
        2.3.1 單克隆抗體的純化與活性檢測(cè)
        2.3.2 DTT還原二硫鍵的最佳條件優(yōu)化
            2.3.2.1 還原反應(yīng)條件的優(yōu)化
            2.3.2.2 抗體與DTT的摩爾比例的優(yōu)化
            2.3.2.3 ELISA檢測(cè)還原抗體的活性
        2.3.3 Sulfo-SMCC與抗吖啶酯抗體反應(yīng)的摩爾比例
        2.3.4 雙特異性抗體偶聯(lián)的結(jié)果
        2.3.5 化學(xué)發(fā)光方法檢測(cè)雙特異性抗體
            2.3.5.1 吖啶酯偶聯(lián)物的選擇
            2.3.5.2 雙特異性抗體的發(fā)光檢測(cè)
    2.4 實(shí)驗(yàn)小結(jié)
第3章 細(xì)胞融合法制備雙特異性抗體
    3.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備與材料
        3.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞
        3.1.2 實(shí)驗(yàn)主要試劑
        3.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器
        3.1.4 溶液的配制方法
    3.2 實(shí)驗(yàn)部分
        3.2.1 小鼠的免疫過(guò)程
        3.2.2 小鼠血清效價(jià)的檢測(cè)
        3.2.3 血清特異性檢測(cè)
        3.2.4 細(xì)胞融合-
            3.2.4.1 抗蘇丹紅I雜交瘤細(xì)胞的缺陷細(xì)胞株的準(zhǔn)備
            3.2.4.2 免疫的小鼠脾細(xì)胞準(zhǔn)備
            3.2.4.3 電融合與三瘤細(xì)胞的培養(yǎng)
        3.2.5 雙特異性的三瘤細(xì)胞篩選
        3.2.6 三瘤細(xì)胞克隆化過(guò)程
        3.2.7 雙特異性抗體的生產(chǎn)
        3.2.8 抗原柱純化雙特異性抗體
            3.2.8.1 抗原柱的準(zhǔn)備
            3.2.8.2 抗原柱緩沖條件的優(yōu)化
            3.2.8.3 抗原柱的緩沖液pH與離子濃度的優(yōu)化
        3.2.9 抗原柱純化抗蘇丹紅I/吖啶酯的雙特異性抗體
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和分析
        3.3.1 免疫小鼠的血清效價(jià)和特異性檢測(cè)
        3.3.2 缺陷型細(xì)胞上清的效價(jià)與抑制效果檢測(cè)
        3.3.3 三瘤雜交細(xì)胞的篩選
        3.3.4 三瘤雜交細(xì)胞的特異性檢測(cè)
        3.3.5 抗原柱純化抗蘇丹紅I/吖啶酯的雙特異性抗體
            3.3.5.1 吖啶酯抗原柱的緩沖條件優(yōu)化
            3.3.5.2 抗原柱緩沖液的pH與離子濃度的優(yōu)化
            3.3.5.3 雙特異性抗的濃度測(cè)定
    3.4 實(shí)驗(yàn)小結(jié)
第4章 基于雙特異性抗體的免疫發(fā)光分析方法研究
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備
        4.1.1 主要試劑
        4.1.2 主要儀器
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 雙特異性抗體與單克隆抗體親和力對(duì)比
        4.2.2 間接酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法
        4.2.3 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法
        4.2.4 間接免疫發(fā)光分析方法
        4.2.5 間接競(jìng)爭(zhēng)免疫發(fā)光分析方法
        4.2.6 發(fā)光反應(yīng)體系的優(yōu)化
            4.2.6.1 抗原濃度優(yōu)化
            4.2.6.2 HRP-AE濃度優(yōu)化
            4.2.6.3 抗體濃度優(yōu)化
            4.2.6.4 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液的優(yōu)化
            4.2.6.5 緩沖液的pH優(yōu)化
            4.2.6.6 緩沖液的離子濃度優(yōu)化
            4.2.6.7 間接競(jìng)爭(zhēng)CLEIA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立
        4.2.7 樣品處理
    4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
        4.3.1 雙特異性抗體與單克隆抗體親和力的比較
        4.3.2 雙特異性抗體與單克隆抗體競(jìng)爭(zhēng)效果的比較
            4.3.2.1 蘇丹紅-BSA包被和抗體濃度的確定
            4.3.2.2 吖啶酯-BSA包被和抗體濃度的確定
            4.3.2.3 雙特異性抗體與單抗競(jìng)爭(zhēng)效果的對(duì)比
        4.3.3 CLIA和 CLEIA的對(duì)比
        4.3.4 雙特異性抗體的CLEIA條件優(yōu)化
            4.3.4.1 抗原濃度的確定
            4.3.4.2 HRP-AE濃度確定
            4.3.4.3 抗體濃度確定
            4.3.4.4 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液的優(yōu)化
            4.3.4.5 緩沖液的pH確定
            4.3.4.6 緩沖液的離子濃度確定
            4.3.4.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立
        4.3.5 加標(biāo)回收測(cè)定
    4.4 實(shí)驗(yàn)小結(jié)
第5章 總結(jié)與展望
參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間的研究成果及所獲榮譽(yù)
致謝



本文編號(hào)：3865717