近年來,癌癥已經(jīng)成為危及人類健康的主要原因之一。研究人員花費(fèi)大量時間對癌癥進(jìn)行靈敏而精確的診斷。DNA分子作為遺傳物質(zhì),參與各種生物體的生存發(fā)育,指導(dǎo)機(jī)體各項(xiàng)生命活動的運(yùn)作。因此,DNA分子的靈敏分析對于癌癥診斷、環(huán)境監(jiān)測和預(yù)后治療等方面都有著重大的意義。它也是現(xiàn)代分析化學(xué)的一項(xiàng)主要研究課題。另一方面,由于腫瘤相關(guān)的外泌體有助于腫瘤的轉(zhuǎn)移、發(fā)展和免疫調(diào)節(jié),且外泌體在體液中相對豐富、采集標(biāo)本時侵襲性小,這使得外泌體在癌癥液體活檢方面具有巨大的潛力。因此本文主要探究了外切酶作用下電化學(xué)檢測DNA和靶向觸發(fā)3D DNA walker對外泌體的超靈敏檢測。(1)準(zhǔn)確、靈敏的DNA分析是了解DNA功能和疾病早期診斷的基礎(chǔ)。因此,本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了λ外切酶(λ-Exo)作用下的電化學(xué)傳感器來檢測靶標(biāo)DNA(tDNA)。在目標(biāo)DNA存在下,λ-Exo作用于5’磷酸化的雙鏈DNA,沿5’→3’方向逐步切去5’單核苷酸。因此,二茂鐵標(biāo)記的DNA鏈可以通過雜交引入到金電極表面,實(shí)現(xiàn)電化學(xué)信號的增加。本工作進(jìn)行了λ-Exo用量和反應(yīng)時間的優(yōu)化。采用電化學(xué)阻抗譜法對其組裝過程進(jìn)行了表征。在優(yōu)化條件下,tDNA可以實(shí)...

【文章頁數(shù)】：83 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 前言
    1.1 基于信號放大的多種超靈敏生物傳感器的構(gòu)建
        1.1.1 外切酶輔助的生物傳感器的構(gòu)建
        1.1.2 DNA酶輔助的生物傳感器的構(gòu)建
        1.1.3 DNA步行器輔助的生物傳感器的構(gòu)建
        1.1.4 比率法生物傳感器的構(gòu)建
    1.2 電化學(xué)DNA生物傳感器
        1.2.1 電化學(xué)DNA生物傳感器的概述
        1.2.2 DNA探針固定方法
            1.2.2.1 吸附結(jié)合法
            1.2.2.2 共價固定法
            1.2.2.3 自組裝法
            1.2.2.4 化學(xué)免疫法
        1.2.3 電化學(xué)檢測技術(shù)
            1.2.3.1 循環(huán)伏安法
            1.2.3.2 交流阻抗法
            1.2.3.3 差分脈沖伏安法
    1.3 外泌體
        1.3.1 外泌體簡介
        1.3.2 外泌體的發(fā)展史
        1.3.3 外泌體的組成成分
        1.3.4 外泌體的分離方式
            1.3.4.1 超速離心法
            1.3.4.2 試劑盒提取法
            1.3.4.3 超濾離心法
            1.3.4.4 體積排阻層析分離法
            1.3.4.5 PEG沉淀法
            1.3.4.6 磁珠免疫法
        1.3.5 外泌體的表征及檢測方法
            1.3.5.1 外泌體的主要表征方式
            1.3.5.2 外泌體的主要檢測方法
        1.3.6 外泌體的應(yīng)用
            1.3.6.1 外泌體作為早期癌癥檢測的新生物標(biāo)志物
            1.3.6.2 外泌體作為納米載體進(jìn)行藥物遞送和癌癥治療
    1.4 主要外泌體表面標(biāo)志物
        1.4.1 CD63
        1.4.2 上皮細(xì)胞黏附分子(EpCAM)
    1.5 本論文的選題背景和主要內(nèi)容
第二章 外切酶作用下電化學(xué)檢測DNA
    2.1 引言
    2.2 實(shí)驗(yàn)部分
        2.2.1 儀器與試劑
        2.2.2 實(shí)驗(yàn)步驟
            2.2.2.1 配制10 m M PBS(p H=7.4)緩沖溶液
            2.2.2.2 配制Tris-HCl(10 m M,p H=7.4)緩沖溶液
            2.2.2.3 電極預(yù)處理
            2.2.2.4 hDNA預(yù)處理
            2.2.2.5 組裝金電極并對tDNA進(jìn)行電化學(xué)檢測
    2.3 結(jié)果與討論
        2.3.1 實(shí)驗(yàn)原理
        2.3.2 實(shí)驗(yàn)可行性分析
        2.3.3 電極修飾的表征
        2.3.4 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化
        2.3.5 對tDNA的靈敏度檢測
        2.3.6 復(fù)雜體系檢測
    2.4 本章小結(jié)
第三章 目標(biāo)觸發(fā)三維DNA步行器和核酸外切酶Ⅲ輔助的電化學(xué)比率生物傳感器對外泌體超靈敏檢測
    3.1 引言
    3.2 實(shí)驗(yàn)部分
        3.2.1 儀器與試劑
        3.2.2 實(shí)驗(yàn)步驟
            3.2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)所需溶液配制
            3.2.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)具體步驟
            3.2.2.3 超速離心法分離外泌體
            3.2.2.4 人血漿中分離外泌體
            3.2.2.5 外泌體透射電鏡
            3.2.2.6 外泌體的免疫蛋白印記
            3.2.2.7 生物素鏈與鏈霉親和素修飾磁珠的偶聯(lián)
            3.2.2.8 DNA步行器的制備
            3.2.2.9 驗(yàn)證目標(biāo)觸發(fā)的DNA酶步行器
            3.2.2.10 聚丙烯酰胺凝膠電泳表征
            3.2.2.11 電化學(xué)檢測
    3.3 結(jié)果與討論
        3.3.1 實(shí)驗(yàn)原理
        3.3.2 外泌體的表征
        3.3.3 實(shí)驗(yàn)可行性驗(yàn)證
            3.3.3.1 DNA與磁珠的特異性識別驗(yàn)證
            3.3.3.2 目標(biāo)觸發(fā)DNA酶步行器的可行性驗(yàn)證
            3.3.3.3 電化學(xué)比率法的可行性驗(yàn)證
        3.3.4 電極修飾的表征
        3.3.5 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化
        3.3.6 MCF-7細(xì)胞分泌外泌體的檢測
        3.3.7 傳感器選擇性檢測
        3.3.8 復(fù)雜生物樣品中外泌體的檢測
    3.4 本章小結(jié)
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀碩士期間發(fā)表的論文



本文編號：3842178