近年來(lái),由于經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展和人民生活水平的提高,食物過(guò)敏日益受到消費(fèi)者的重視。其中,魚類由于味道鮮美、來(lái)源廣泛、營(yíng)養(yǎng)經(jīng)濟(jì)價(jià)值高而受到廣大消費(fèi)者的歡迎,但魚卻是易引起食物過(guò)敏反應(yīng)的八大類食品之一。報(bào)道顯示,13%以上的食物過(guò)敏由魚類引起,而其中90%是由魚類中的小清蛋白導(dǎo)致。小清蛋白具有很強(qiáng)的耐高溫、耐酶解特性,難以通過(guò)普通的食品加工及烹飪過(guò)程消除其致敏原性。目前,小清蛋白的定量檢測(cè)方法主要有ELISA法和PCR法。然而,這兩類方法均存在前處理復(fù)雜、操作成本高、測(cè)試時(shí)間長(zhǎng)等一系列局限性。基于上述問(wèn)題,本研究旨在構(gòu)建一種可以快速、準(zhǔn)確檢測(cè)小清蛋白的雙模式生物傳感器。主要研究?jī)?nèi)容如下:(1)通過(guò)組合浸提、硫酸銨沉淀和DEAE離子交換層析等方法提取及純化鱈魚中的小清蛋白。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳、ELISA及免疫印跡技術(shù)分析表征目標(biāo)純化蛋白的性質(zhì),并結(jié)合質(zhì)譜對(duì)小清蛋白進(jìn)行確證。結(jié)果顯示,經(jīng)上述方法提取的小清蛋白的純度達(dá)99%以上,分子量為11.5 kDa,具有較強(qiáng)的免疫活性反應(yīng)。(2)采用免固定化氧化石墨烯篩選法(GO-SELEX),在隨機(jī)ssDNA文庫(kù)中篩選能夠特異性識(shí)別小清蛋白的核酸適配體。...

【文章頁(yè)數(shù)】：103 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮寫及中英文對(duì)照表
第1章 引言
    1.1 魚類致敏原及其檢測(cè)概況
        1.1.1 食物過(guò)敏
        1.1.2 魚類主要致敏原
        1.1.3 魚類致敏原檢測(cè)方法研究進(jìn)展
    1.2 核酸適配體在食品安全檢測(cè)中的研究進(jìn)展
        1.2.1 核酸適配體
        1.2.2 核酸適配體篩選方法
        1.2.3 核酸適配體在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用
    1.3 納米金在食品安全檢測(cè)中的研究進(jìn)展
        1.3.1 納米金
        1.3.2 納米金在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用
    1.4 主要研究?jī)?nèi)容及意義
        1.4.1 研究意義及目的
        1.4.2 研究?jī)?nèi)容
        1.4.3 技術(shù)路線
第2章 魚小清蛋白提純、鑒定和結(jié)構(gòu)分析
    2.1 前言
    2.2 儀器與試劑
        2.2.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象
        2.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器
        2.2.3 實(shí)驗(yàn)試劑
    2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 魚小清蛋白的提取
        2.3.2 魚小清蛋白的純化
        2.3.3 BCA法濃度分析
        2.3.4 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析
        2.3.5 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)鑒定
        2.3.6 紫外-可見光光譜(UV-vis)分析
        2.3.7 圓二色光譜(CD)分析
        2.3.8 傅里葉變換紅外光譜(FTIR)分析
        2.3.9 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)分析
        2.3.10 蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)分析
    2.4 結(jié)果與討論
        2.4.1 魚小清蛋白初步純化結(jié)果
        2.4.2 DEAE Sepharose FF離子交換柱純化魚小清蛋白
        2.4.3 SDS-PAGE分析魚小清蛋白純度
        2.4.4 HPLC-MS/MS分析魚小清蛋白
        2.4.5 UV-vis分析魚小清蛋白
        2.4.6 魚小清蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析
        2.4.7 魚小清蛋白免疫原性分析
    2.5 小結(jié)
第3章 魚小清蛋白核酸適配體的篩選
    3.1 前言
    3.2 儀器與試劑
        3.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器
        3.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        3.2.3 隨機(jī)ssDNA文庫(kù),引物和適配體序列
    3.3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.3.1 氧化石墨烯法(GO-SELEX)篩選
        3.3.2 高通量測(cè)序分析
        3.3.3 生物膜干涉技術(shù)(BLI)分析
        3.3.4 氧化石墨烯熒光法分析
    3.4 結(jié)果與討論
        3.4.1 氧化石墨烯表征
        3.4.2 氧化石墨烯與隨機(jī)ssDNA文庫(kù)吸附條件優(yōu)化
        3.4.3 PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化
        3.4.4 PCR產(chǎn)物純化與酶切
        3.4.5 熒光定量PCR(q PCR)法確定GO-SELEX篩選輪數(shù)
        3.4.6 高通量測(cè)序結(jié)果分析
        3.4.7 生物膜干涉技術(shù)(BLI)親和力分析
        3.4.8 氧化石墨烯熒光法特異性分析
    3.5 小結(jié)
第4章 基于適配體-納米金雙模式生物傳感器的魚小清蛋白快速檢測(cè)研究
    4.1 前言
    4.2 儀器與試劑
        4.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器
        4.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        4.2.3 ssDNA序列
    4.3 實(shí)驗(yàn)方法
        4.3.1 納米金的制備與表征
        4.3.2 AuNPs-DNA探針的制備與表征
        4.3.3 基于適配體-納米金雙模式生物傳感器的魚小清蛋白快速檢測(cè)方法構(gòu)建
        4.3.4 基于適配體-納米金雙模式生物傳感器的魚小清蛋白快速檢測(cè)方法學(xué)考察
    4.4 結(jié)果與討論
        4.4.1 納米金理化性質(zhì)研究
        4.4.2 AuNPs-DNA探針表征
        4.4.3 適配體-納米金雙模式生物傳感器的優(yōu)化
        4.4.4 基于適配體-納米金雙模式生物傳感器檢測(cè)魚小清蛋白方法學(xué)考察
    4.5 小結(jié)
第5章 總結(jié)與展望
    5.1 總結(jié)
    5.2 創(chuàng)新點(diǎn)
    5.3 展望
參考文獻(xiàn)
后記



本文編號(hào)：3808178