毛細管電泳(Capillary electrophoresis,CE)又稱高效毛細管電泳(High-performance capillary electrophoresis,HPCE),是目前應用非常廣泛的一種分離分析技術。因具有高效、快速和樣品消耗少等特點,非常適用于小分子RNA(microRNA,miRNA)這些易分解化合物的分離分析。MiRNA是一系列內源性的、非編碼的短鏈小分子RNA,對生物體內基因的表達起著關鍵性的作用,許多癌癥和疾病的發(fā)生都與特定miRNA的異常表達有著密切的關系。目前miRNA已逐漸成為重要的疾病診斷的生物標志物。miRNA的分析技術貫穿miRNA的研究和藥物研發(fā)過程,并起到關鍵作用。因此,研究對miRNA的分離和高靈敏度檢測技術在未來的臨床診斷中有著非常重要的作用。本論文主要由以下幾個部分組成:第一章,主要對CE的研究進展、分離模式、檢測方法、進樣方式和在線富集技術等進行了綜述。此外,還對miRNA及其檢測方法進行了介紹。第二章,采用高速毛細管電泳(HSCE)激光誘導熒光檢測法(LIF),在動態(tài)凝膠電泳模式下對3個miRNA,miRNA-156、miR...

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【學位級別】：碩士

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中文摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 毛細管電泳簡介
        1.1.1 毛細管電泳的發(fā)展歷史
        1.1.2 毛細管電泳的原理
        1.1.3 高速毛細管電泳
        1.1.4 毛細管的分離模式
            1.1.4.1 毛細管區(qū)帶電泳
            1.1.4.2 毛細管凝膠電泳
            1.1.4.3 毛細管膠束電動色譜
            1.1.4.4 毛細管等電聚焦
            1.1.4.5 毛細管等速電泳
            1.1.4.6 毛細管電色譜
    1.2 毛細管電泳的檢測方式
        1.2.1 激光誘導熒光檢測法
        1.2.2 電化學檢測法
            1.2.2.1 安培檢測法
            1.2.2.2 電導檢測法
            1.2.2.3 電位檢測法
        1.2.3 化學發(fā)光檢法
        1.2.4 紫外/可見吸收檢測法
        1.2.5 質譜檢測法
    1.3 毛細管電泳的進樣方式
        1.3.1 常規(guī)毛細管電泳的進樣方式
            1.3.1.1 電動進樣
            1.3.1.2 擴散進樣
            1.3.1.3 壓力進樣
            1.3.1.4 自發(fā)進樣
        1.3.2 HSCE進樣方式-缺口管進樣
    1.4 毛細管電泳在線富集技術
        1.4.1 堆積
            1.4.1.1 場放大樣品堆積
            1.4.1.2 大體積樣品堆積
            1.4.1.3 場放大樣品進樣
        1.4.2 固相萃取
        1.4.3 瞬時等速電泳
    1.5 MicroRNA簡介
    1.6 MicroRNA的檢測技術
        1.6.1 Northern Blotting法
        1.6.2 微陣列芯片技術
        1.6.3 反轉錄-聚合酶鏈式反應
        1.6.4 滾環(huán)擴增技術
        1.6.5 均相LCR方法
        1.6.6 雜交鏈式反應
        1.6.7 CE在miRNA分析中的應用
    1.7 本論文研究內容簡介
第二章 基于短毛細管高速電泳系統(tǒng)快速分離檢測芭蕉葉中的miRNA
    2.1 引言
    2.2 實驗部分
        2.2.1. 高速毛細管電泳系統(tǒng)
        2.2.2 試劑
        2.2.3 實驗儀器
        2.2.4 溶液的配制
        2.2.5 樣品溶液的制備
        2.2.6 實驗步驟
        2.2.7 電泳條件
    2.3 結果與討論
        2.3.1 無場放大進樣
        2.3.2 進樣方式的對比
        2.3.3 有無去光反饋對比
    2.4 動態(tài)凝膠電泳分離條件優(yōu)化
        2.4.1 緩沖液體系的選擇
        2.4.2 pH的優(yōu)化
        2.4.3 篩分介質HEC濃度的選擇
        2.4.4 篩分介質PVP濃度的選擇
        2.4.5 分離電壓的優(yōu)化
        2.4.6 緩沖液濃度的優(yōu)化
    2.5 工作曲線和檢測限
    2.6 DNA探針的特異性
    2.7 香蕉葉中miRNA分析
        2.7.1 回收率的測定
    2.8 結論
第三章 基于核酸等溫雜交鏈式反應與短毛細管高速電泳聯(lián)用技術快速分離檢測A549細胞中的miRNA
    3.1 引言
    3.2 實驗部分
        3.2.1 試劑
        3.2.2 實驗儀器
        3.2.3 溶液的配制
    3.3 實驗步驟
    3.4 基于HCR與超濾管高靈敏度檢測miRNA的實驗原理
    3.5 miRNA引發(fā)HCR反應的驗證
    3.6 采用超濾管去除H1、H2單體的可行性分析
    3.7 等溫雜交鏈式反應產物峰合并的條件優(yōu)化
        3.7.1 緩沖液類型的選擇
        3.7.2 毛細管有效長度的優(yōu)化
        3.7.3 緩沖液pH值的優(yōu)化
        3.7.4 篩分介質HEC的優(yōu)化
        3.7.5 分離電壓的優(yōu)化
    3.8 等溫雜交鏈式反應條件的優(yōu)化
        3.8.1 等溫雜交鏈式反應時間的優(yōu)化
        3.8.2 等溫雜交鏈式反應體系pH的優(yōu)化
    3.9 工作曲線和檢測限
    3.10 DNA探針的特異性
    3.11 A549細胞中的miRNA分析
        3.11.1 回收率的測定
    3.12 結論
第四章 集成銅微儲液池的毛細管高速電泳快速分離檢測木瓜葉中的miRNA
    4.1 引言
    4.2 實驗部分
        4.2.1 試劑
        4.2.2 實驗儀器
        4.2.3 溶液配制
        4.2.4 實驗裝置
            4.2.4.1 激光誘導熒光檢測系統(tǒng)
            4.2.4.2 短毛細管高速電泳分離系統(tǒng)
        4.2.5 實驗步驟
    4.3 裝置重現(xiàn)性的考察
    4.4 結果與討論
        4.4.1 miRNA-156與C2分離條件的優(yōu)化
            4.4.1.1 運行緩沖液pH值的優(yōu)化
            4.4.1.2 篩分介質PVP含量的優(yōu)化
            4.4.1.3 篩分介質HEC含量的優(yōu)化
            4.4.1.4 分離電壓的優(yōu)化
        4.4.2 工作曲線和檢測限
        4.4.3 木瓜葉中miRNA的測定
        4.4.4 回收率的測定
    4.5 結論
參考文獻
致謝
個人簡歷



本文編號：3802545