暴露于環(huán)境毒物和壓力源、輻射、藥物、炎癥、細(xì)胞呼吸以及常規(guī)DNA代謝都會導(dǎo)致細(xì)胞毒性DNA鏈斷裂的產(chǎn)生,DNA鏈斷裂后通常缺少DNA合成和DNA連接所需的5’-磷酸和3’-羥基的部分。如果不能解決DNA末端的損傷,會導(dǎo)致DNA復(fù)制和修復(fù)異常,造成基因組不穩(wěn)定性、誘變、神經(jīng)疾病、衰老以及癌的發(fā)生。T4多聚核苷酸激酶(T4 PNK)是生物體內(nèi)常見的激酶之一,具有5’-激酶和3’-磷酸酶活性。該酶的5’-激酶活性能夠催化ATP的γ-磷酸轉(zhuǎn)移到多核苷酸的5’-羥基末端,是修復(fù)生物體基因損傷的重要生物酶。傳統(tǒng)上多采用放射性同位素³²P-標(biāo)記、聚丙烯酰胺凝膠電泳和放射自顯影測定DNA的磷酸化和T4 PNK活性。這些方法過程繁瑣、耗時費力且放射性標(biāo)記會引起健康問題。近年來,納米孔單分子技術(shù)因其具有免標(biāo)記、高通量、低成本等優(yōu)勢而迅速成為分析化學(xué)領(lǐng)域極具潛力的檢測手段。本文以α-溶血素(α-hemolysin,α-HL)蛋白質(zhì)納米孔為傳感元件,設(shè)計使用發(fā)夾結(jié)構(gòu)的DNA,實現(xiàn)了DNA磷酸化和T4多聚核苷酸激酶的單分子檢測分析。本論文主要研究內(nèi)容如下:1、文獻(xiàn)綜述本章簡要綜述了單分子技...

【文章頁數(shù)】：84 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 單分子分析技術(shù)的研究進(jìn)展
    1.2 納米孔單分子分析技術(shù)的研究進(jìn)展
        1.2.1 納米孔單分子技術(shù)的檢測原理
        1.2.2 納米孔的分類
    1.3 α-溶血素納米孔簡介
    1.4 α-溶血素納米孔在檢測基因表觀遺傳修飾方面的應(yīng)用
        1.4.1 DNA甲基化的檢測
        1.4.2 DNA損傷的檢測
        1.4.3 Micro RNA的檢測
        1.4.4 G-四鏈體及其折疊過程的檢測
    1.5 α-溶血素納米孔在單分子酶反應(yīng)研究方面的應(yīng)用
    1.6 T4多聚核苷酸激酶
        1.6.1 T4PNK簡介
        1.6.2 T4PNK活性的檢測以及抑制劑的篩選
    1.7 本課題的研究意義
    參考文獻(xiàn)
第二章 基于α-HL納米孔單分子技術(shù)對DNA磷酸化的檢測
    2.1 前言
    2.2 實驗部分
        2.2.1 實驗試劑
        2.2.2 實驗儀器
        2.2.3 實驗裝置
        2.2.4 電解池和電極的制備
        2.2.5 磷脂雙分子層的形成
        2.2.6 天然α-HL蛋白質(zhì)(WT)7的制備
        2.2.7 DNA序列
        2.2.8 溶液的配制
        2.2.9 單通道電流記錄及數(shù)據(jù)處理
    2.3 結(jié)果與討論
        2.3.1 α-HL(WT)7納米通道檢測5'-磷酸化與未磷酸化的發(fā)夾DNA
        2.3.2 電壓對發(fā)夾DNA穿孔信號的影響
        2.3.3 鹽濃度對發(fā)夾DNA穿孔信號的影響
        2.3.4 發(fā)夾DNA莖部的堿基配對數(shù)對5'-磷酸化檢測的影響
        2.3.5 3 '-磷酸化對發(fā)夾DNA結(jié)構(gòu)的影響
        2.3.6 5 '-磷酸化與3'-磷酸化對發(fā)夾DNA結(jié)構(gòu)影響的綜合對比
        2.3.7 5'-磷酸化對發(fā)夾DNA與 Dox結(jié)合的影響
    2.4 結(jié)論
    參考文獻(xiàn)
第三章 基于納米孔單分子技術(shù)檢測T4多聚核苷酸激酶活性
    3.1 前言
    3.2 實驗部分
        3.2.1 實驗試劑
        3.2.2 實驗儀器
        3.2.3 電解池和電極的準(zhǔn)備
        3.2.4 磷脂雙分子層的形成
        3.2.5 天然α-HL蛋白質(zhì)(WT)7的制備
        3.2.6 溶液的配制
        3.2.7 DNA序列
        3.2.8 實驗步驟
    3.3 結(jié)果與討論
        3.3.1 檢測原理分析
        3.3.2 實驗方法的可行性研究
        3.3.3 T4PNK活性分析
        3.3.4 分析方法的選擇性研究
        3.3.5 實際樣本的檢測
        3.3.6 T4PNK激酶抑制劑分析
    3.4 結(jié)論
    參考文獻(xiàn)
結(jié)論
攻讀碩士學(xué)位期間取得的科研成果
致謝



本文編號：3778775