環(huán)糊精(Cyclodextrins,CDs)是指由6個(gè)及以上葡萄糖單元通過α-1,4-糖苷鍵首尾相連形成的低聚糖化合物。常見的CD中,γ-CD因具有空腔大、溶解性好、安全性高的特質(zhì),在食品、醫(yī)藥、生物等領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊,其主要利用γ-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(γ-Cyclodextrin Glycosyltransferase,γ-CGTase)的環(huán)化活力轉(zhuǎn)化淀粉而生成。目前,已報(bào)道的γ-CGTase存在種類較少且熱穩(wěn)定性差的問題,無(wú)法滿足淀粉底物糊化狀態(tài)下的催化需求,因此發(fā)掘新型γ-CGTase并提高其熱穩(wěn)定性對(duì)推動(dòng)γ-CD生產(chǎn)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本課題以來源于Bacillus sp.FJAT-44876的γ-CGTase為研究對(duì)象,探究了其酶學(xué)性質(zhì),并通過Ca²⁺及定點(diǎn)突變進(jìn)一步提高其熱穩(wěn)定性,旨在為γ-CGTase熱穩(wěn)定性基礎(chǔ)研究提供參考和γ-CD生產(chǎn)提供新的選擇。通過序列比對(duì)、克隆表達(dá)、分離純化,得到一個(gè)具有高熱穩(wěn)定性潛質(zhì)的新型γ-CGTase并對(duì)其進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究。將其克隆表達(dá)后,利用鎳親和層析進(jìn)行分離純化以及SDS-PAGE進(jìn)一步驗(yàn)證。結(jié)果顯示,電泳圖譜中...

【文章頁(yè)數(shù)】：64 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮寫符號(hào)說明
1 緒論
    1.1 γ-環(huán)糊精(γ-CD)概述
        1.1.1 γ-CD的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)
        1.1.2 γ-CD的應(yīng)用
        1.1.3 γ-CD的制備
    1.2 γ-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(γ-CGTase)概述
        1.2.1 γ-CGTase的來源
        1.2.2 γ-CGTase的結(jié)構(gòu)與功能
        1.2.3 γ-CGTase的催化反應(yīng)機(jī)理
        1.2.4 CGTase的應(yīng)用
        1.2.5 γ-CGTase的研究現(xiàn)狀
    1.3 酶熱穩(wěn)定性提高策略及其在CGTase中應(yīng)用
        1.3.1 酶熱穩(wěn)定性提高策略概述
        1.3.2 CGTase熱穩(wěn)定性研究概況
    1.4 立題依據(jù)及意義
    1.5 主要研究?jī)?nèi)容
2 材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器
        2.1.1 菌株及質(zhì)粒
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 γ-CGTase基因挖掘及克隆表達(dá)
        2.2.2 重組γ-CGTase的菌體培養(yǎng)
        2.2.3 重組γ-CGTase的分離純化
        2.2.4 SDS-PAGE凝膠電泳
        2.2.5 蛋白濃度的測(cè)定
        2.2.6 重組γ-CGTase環(huán)化活力的測(cè)定
        2.2.7 重組γ-CGTase的定性分析
        2.2.8 重組γ-CGTase酶學(xué)性質(zhì)的測(cè)定
        2.2.9 Ca²⁺濃度對(duì)重組γ-CGTase的影響
        2.2.10 內(nèi)源熒光性的測(cè)定
        2.2.11 差示掃描微量熱分析(Nano DSC)
        2.2.12 同源建模分析
        2.2.13 不同因素對(duì)γ-CD制備的影響
        2.2.14 高效液相色譜(HPLC)
        2.2.15 超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC-MS)
        2.2.16 突變體的構(gòu)建
        2.2.17 突變體的表達(dá)及性質(zhì)鑒定
        2.2.18 突變體的熱穩(wěn)定性分析
        2.2.19 數(shù)據(jù)處理
3 結(jié)果與討論
    3.1 重組γ-CGTase克隆表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)表征
        3.1.1 γ-CGTase生物信息學(xué)的分析
        3.1.2 重組蛋白質(zhì)的分離純化
        3.1.3 重組γ-CGTase的定性分析
        3.1.4 重組γ-CGTase酶學(xué)性質(zhì)的測(cè)定
    3.2 Ca²⁺對(duì)γ-CGTase熱穩(wěn)定性的影響
        3.2.1 Ca²⁺濃度對(duì)重組γ-CGTase環(huán)化活力的影響
        3.2.2 Ca²⁺濃度對(duì)重組γ-CGTase熱穩(wěn)定性的影響
        3.2.3 Ca²⁺提高重組γ-CGTase熱穩(wěn)定性的機(jī)理分析
        3.2.4 不同因素對(duì)γ-CD制備的影響
    3.3 定點(diǎn)突變對(duì)熱穩(wěn)定性的影響
        3.3.1 突變點(diǎn)的選擇
        3.3.2 突變體的分離純化
        3.3.3 突變體的定性分析
        3.3.4 突變體最適溫度及熱穩(wěn)定性的測(cè)定
        3.3.5 突變體熱穩(wěn)定性的分析
主要結(jié)論與展望
    主要結(jié)論
    展望
致謝
參考文獻(xiàn)
附錄1
附錄2 :作者在攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文



本文編號(hào)：3778413