蛋白質(zhì)作為細(xì)胞生物功能的執(zhí)行者主要取決于它們的三維結(jié)構(gòu),其中既包括天然折疊的結(jié)構(gòu)蛋白,也有缺乏穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的固有無序蛋白。不同的蛋白可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞不同的生理過程,蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的解析有助于闡明蛋白質(zhì)行使功能的分子機(jī)制。因此,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究一直是生命科學(xué)領(lǐng)域中的一個(gè)重要部分。蛋白質(zhì)與配體的相互作用是細(xì)胞實(shí)現(xiàn)特定功能的基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)-配體相互作用作為細(xì)胞內(nèi)一種極其重要的生物分子活動(dòng)參與細(xì)胞周期的各個(gè)生物學(xué)過程,諸如信號(hào)傳導(dǎo)、能量代謝、基因調(diào)控、酶催化、免疫反應(yīng)等過程均伴隨著相關(guān)蛋白質(zhì)與底物、配體或小分子的結(jié)合。蛋白質(zhì)-配體相互作用及其組成的作用網(wǎng)絡(luò)的研究不僅有助于我們認(rèn)識(shí)生命活動(dòng)的分子機(jī)制,同時(shí)對(duì)臨床疾病的診斷和治療也具有重要意義。核磁共振波譜作為研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和與其它生物分子相互作用的重要方法,特別是對(duì)溶液中蛋白質(zhì)的研究獨(dú)具優(yōu)勢(shì)。本論文選取了三個(gè)蛋白一人源蛋白GAS7-SH3,羊駝納米抗體Nb26(兩者均為天然折疊蛋白)和人源蛋白TGIF1-RD2(預(yù)測(cè)為內(nèi)源性無序蛋白)作為研究對(duì)象,基于核磁共振波譜方法并結(jié)合其它生物物理和生物化學(xué)方法對(duì)它們的結(jié)構(gòu)與功能展開研究,具體的研究結(jié)果如下:1.人源蛋白...

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略語(yǔ)表
第1章 引言
    1.1 研究對(duì)象概述
        1.1.1 生長(zhǎng)阻滯特異性蛋白GAS7研究概述
        1.1.2. 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)作用因子TGIF1的研究概述
        1.1.3 納米抗體研究概述
    1.2 核磁共振研究蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)
        1.2.1 核磁共振技術(shù)的基本原理及特征
        1.2.2 核磁共振解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的基本參數(shù)
            1.2.2.1 化學(xué)位移
            1.2.2.2 自旋耦合
            1.2.2.3 核奧弗豪塞效應(yīng)
        1.2.3 核磁共振解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的一般流程
            1.2.3.1 同位素標(biāo)記蛋白樣品的制備
            1.2.3.2 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的采集與處理
            1.2.3.3 蛋白質(zhì)原子的化學(xué)位移歸屬
            1.2.3.4 結(jié)構(gòu)計(jì)算約束條件的獲取
            1.2.3.5 結(jié)構(gòu)計(jì)算與優(yōu)化
    1.3 蛋白質(zhì)與配體相互作用的研究方法
        1.3.1 核磁滴定
        1.3.2 噬菌體展示技術(shù)
        1.3.3 酵母雙雜交技術(shù)
        1.3.4 酶聯(lián)免疫吸附法
    1.4 課題研究的出發(fā)點(diǎn)
第2章 GAS7-SH3的結(jié)構(gòu)解析與特異性多肽配體的篩選
    2.1 引言
    2.2 實(shí)驗(yàn)材料和方法
        2.2.1 材料與儀器
            2.2.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑
            2.2.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器
        2.2.2 GAS7-SH3重組質(zhì)粒的構(gòu)建
            2.2.2.1 目的基因的擴(kuò)增
            2.2.2.2 目的基因的回收以及載體的酶切、酶連
            2.2.2.3 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、提取與鑒定
        2.2.3 GAS7-SH3的表達(dá)與純化
            2.2.3.1 GAS7-SH3的表達(dá)
            2.2.3.2 ¹⁵N標(biāo)記和¹³C,¹⁵N標(biāo)記的蛋白表達(dá)
            2.2.3.3 GAS7-SH3的純化
            2.2.3.4 多肽儲(chǔ)液的配制
        2.2.4 GAS7-SH3的樣品表征
            2.2.4.1 質(zhì)譜測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量
            2.2.4.2 靜態(tài)光散射實(shí)驗(yàn)
        2.2.5 GAS7-SH3的結(jié)構(gòu)解析
            2.2.5.1 GAS7-SH3核磁數(shù)據(jù)采集與處理
            2.2.5.2 GAS7-SH3化學(xué)位移歸屬與結(jié)構(gòu)計(jì)算
        2.2.6 GAS7-SH3蛋白特異性多肽配體的篩選
            2.2.6.1 噬菌體肽文庫(kù)的擴(kuò)增
            2.2.6.2 噬菌體肽文庫(kù)的淘選
            2.2.6.3 噬菌體滴度的測(cè)定
            2.2.6.4 陽(yáng)性噬菌體克隆的鑒定與序列測(cè)定
        2.2.7 多肽配體與GAS7-SH3蛋白的核磁滴定
    2.3 結(jié)果與討論
        2.3.1 GAS7-SH3的樣品制備
        2.3.2 GAS7-SH3的液體核磁結(jié)構(gòu)
        2.3.3 GAS7-SH3蛋白的功能預(yù)測(cè)
            2.3.3.1 基于蛋白質(zhì)序列相似性的功能預(yù)測(cè)
            2.3.3.2 基于蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的功能預(yù)測(cè)
        2.3.4 P41與GAS7-SH3蛋白的核磁滴定
        2.3.5 GAS7-SH3蛋白特異性多肽配體的篩選
    2.4 小結(jié)
第3章 TGIF1-RD2的同源寡聚及其識(shí)別輔阻遏蛋白SIN3A-PAH的分子機(jī)制研究
    3.1 引言
    3.2 實(shí)驗(yàn)材料與方法
        3.2.1 材料與儀器
        3.2.2 TGIF1-RD2(256-375,256-401)及SIN3A-PAH2重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.2.3 TGIF1-RD2(256-401)突變體的構(gòu)建
        3.2.4 TGIF1-RD2(256-375,256-401)及SIN3A-PAH2的表達(dá)與純化
            3.2.4.1 TGIF1-RD2(256-375)的表達(dá)與純化
            3.2.4.2 TGIF1-RD2(256-401)的表達(dá)與純化
            3.2.4.3 SIN3A-PAH2的表達(dá)與純化
        3.2.5 樣品表征
        3.2.6 圓二色譜實(shí)驗(yàn)
        3.2.7 TGIF1-RD2(256-401)的主鏈化學(xué)位移歸屬
        3.2.8 酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)
        3.2.9 TGIF1-RD2(256-375,256-401)與SIN3A-PAH2的核磁滴定
    3.3 結(jié)果與討論
        3.3.1 TGIF1-RD2(256-375,256-401)和SIN3A-PAH2的樣品制備
            3.3.1.1 TGIF1-RD2(256-375)的樣品制備
            3.3.1.2 TGIF1-RD2(256-401)的樣品制備
            3.3.1.3 SIN3A-PAH2的樣品制備
        3.3.2 TGIF1-RD2(256-401)的結(jié)構(gòu)特征
        3.3.3 TGIF1-RD2(256-401)的同源寡聚
            3.3.3.1 TGIF1-RD2(256-401)在細(xì)胞內(nèi)的同源寡聚
            3.3.3.2 TGIF1-RD2(256-401)在溶液中的同源寡聚
        3.3.4 TGIF1-RD2(256-401)與SIN3A-PAH2的相互作用
    3.4 小結(jié)
第4章 納米抗體Nb26識(shí)別黃曲霉毒素AFB1的分子機(jī)制研究
    4.1 引言
    4.2 實(shí)驗(yàn)材料和方法
        4.2.1 材料與儀器
        4.2.2 Nb26重組質(zhì)粒的構(gòu)建
            4.2.2.1 分子伴侶的感受態(tài)細(xì)胞制備
            4.2.2.2 目的基因的擴(kuò)增
        4.2.3 Nb26的表達(dá)與純化
        4.2.4 Nb26的樣品表征
        4.2.5 Nb26的結(jié)構(gòu)解析
            4.2.5.1 Nb26的核磁實(shí)驗(yàn)采集、數(shù)據(jù)處理及結(jié)構(gòu)計(jì)算
            4.2.5.2 Nb26的T₁、T₂、{¹H}-¹⁵N NOE實(shí)驗(yàn)
        4.2.6 熒光滴定
        4.2.7 AFB₁與Nb26的核磁滴定
        4.2.8 holo-Nb26的主鏈化學(xué)位移歸屬
    4.3 結(jié)果與討論
        4.3.1 Nb26的可溶性表達(dá)
        4.3.2 Nb26的樣品制備
        4.3.3 Nb26的液體核磁結(jié)構(gòu)
        4.3.4 Nb26與AFB1的相互作用
    4.4 小結(jié)
第5章 總結(jié)與展望
    5.1 GAS7-SH3結(jié)構(gòu)解析及其特異性多肽配體的篩選
    5.2 TGIF1-RD2的同源寡聚及其識(shí)別輔阻遏蛋白SIN3A-PAH2的分子機(jī)制研究
    5.3 納米抗體Nb26識(shí)別黃曲霉毒素AFB1的分子機(jī)制研究
    5.4 展望
參考文獻(xiàn)
附錄A 國(guó)際理論與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)各氨基酸原子命名法
附錄B 實(shí)驗(yàn)室常用培養(yǎng)基及緩沖液配制
附錄C T₁、T₂、{¹H}-¹⁵N NOE的處理腳本
附錄D GAS7-SH3的結(jié)構(gòu)質(zhì)量統(tǒng)計(jì)表a

附錄E Nb26的結(jié)構(gòu)質(zhì)量統(tǒng)計(jì)表^a

附錄F holo-Nb26的主鏈化學(xué)位移歸屬結(jié)果
致謝
作者簡(jiǎn)歷及攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與研究成果



本文編號(hào)：3751643

boshi