多核苷酸激酶（Polynucleotide Kinase,PNK）是一種細(xì)胞內(nèi)重要的修復(fù)酶,參與堿基切除修復(fù)（Base-excision repair,BER）和非同源末端連接修復(fù)（Non-homologous End Joining,NHEJ）。多核苷酸激酶能夠催化磷酸基團(tuán)從三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate,ATP）轉(zhuǎn)移到DNA/RNA的5’-羥基末端,使其5’-末端磷酸化,從而參與DNA重組、DNA復(fù)制和DNA損傷修復(fù)等多種細(xì)胞過程。多核苷酸激酶活性異常會干擾細(xì)胞修復(fù)系統(tǒng)的穩(wěn)定性,并誘發(fā)一系列人類疾病,如湯姆森綜合征、沃納綜合征、神經(jīng)退行性疾病、癌癥等。因此,多核苷酸激酶被認(rèn)為是重要的潛在生物標(biāo)志物,可用于多種疾病的診斷和治療,亟待發(fā)展高效、靈敏的多核苷酸激酶檢測方法。然而,目前的檢測方法通常存在程序繁瑣、檢測時間長、靈敏度低等問題。本論文為了克服以上不足,發(fā)展了一種簡單快速、特異性好、靈敏度高的多核苷酸激酶檢測方法。本論文中,我們提出了一種連接酶介導(dǎo)的恒溫擴(kuò)增方法用于多核苷酸激酶檢測研究。我們以雙鏈特異性核酸酶（Duplex-specific nuclea... 

【文章來源】：山東師范大學(xué)山東省

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【學(xué)位級別】：碩士

【圖文】：

T4多核苷酸激酶結(jié)構(gòu)示意圖

山東師范大學(xué)碩士學(xué)位論文2構(gòu)域，其C端發(fā)揮3"-磷酸酶功能，N端參與5"-激酶反應(yīng)。T4多核苷酸激酶是一種重要的核酸末端處理酶，能夠?qū)⑷姿嵯佘盏摩梦涣姿峄鶊F(tuán)轉(zhuǎn)移到DNA或RNA中來催化5"-羥基末端磷酸化（如圖1-2），這個過程在核酸代謝以及各種損傷修復(fù)中起著至關(guān)重要的作用[8-10]。圖1-2多核苷酸激酶催化反應(yīng)。1.1.2多核苷酸激酶的生物功能基因組的完整性和穩(wěn)定性對于生物體來說是非常重要的，人體內(nèi)高頻發(fā)生的DNA損傷將嚴(yán)重威脅基因組穩(wěn)定性會導(dǎo)致遺傳突變，進(jìn)而誘導(dǎo)疾病的發(fā)生[11]。DNA損傷有很多種類型，其中最嚴(yán)重的是細(xì)胞內(nèi)每天因DNA堿基損傷或DNA糖損傷而產(chǎn)生的數(shù)千條DNA單鏈斷裂，如果損傷得不到修復(fù)，這種斷裂可以在DNA復(fù)制過程中轉(zhuǎn)化為雙鏈斷裂，并可能導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定和細(xì)胞死亡[12-14]。大多數(shù)DNA修復(fù)是通過DNA連接酶在5"-磷酸和3"-羥基末端之間的連接來實現(xiàn)的。然而，許多DNA單鏈斷裂與5"-羥基末端的產(chǎn)生有關(guān)，該末端應(yīng)在連接酶介導(dǎo)的DNA修復(fù)之前被激酶預(yù)磷酸化[15]。因此，5"-羥基末端的磷酸化對于修復(fù)此類DNA損傷至關(guān)重要。多核苷酸激酶是許多核酸末端處理酶中的一種，將5"-羥基末端轉(zhuǎn)化為5"-磷酸末端，該酶與適當(dāng)?shù)倪B接酶一起修復(fù)核酸中的單鏈斷裂[16]。多核苷酸激酶在調(diào)節(jié)DNA磷酸化水平，修復(fù)DNA損傷和維持基因組穩(wěn)定性中起關(guān)鍵作用，其活性異�？赡軐�(dǎo)致許多細(xì)胞過程失調(diào)（例如DNA復(fù)制、DNA重組和鏈斷裂的DNA損傷修復(fù)），并誘導(dǎo)

山東師范大學(xué)碩士學(xué)位論文5消化。當(dāng)互補(bǔ)序列的所有核苷酸被完全去除時，HRPzyme的催化活性被徹底釋放。當(dāng)H2O2存在時，與血紅素結(jié)合后，釋放的HRPzyme催化無色ABTS2-到有色ABTS的翻轉(zhuǎn)。不存在PNK的情況下，G4-發(fā)夾探針的5"末端仍保持羥基化，幾乎不發(fā)生切割反應(yīng)，不能與血紅素結(jié)合，因此無法催化ABTS2-的氧化。因此，可以通過檢測HRPzyme的釋放量來測定PNK的活性。該方法具有成本低和操作簡單等優(yōu)勢，在開發(fā)高通量的磷酸化研究方面具有廣闊的應(yīng)用前景。此外，該策略在研究PNK活性相關(guān)的生化分析過程以及篩選與磷酸化引發(fā)的癌癥相關(guān)的藥物方面具有很大的發(fā)展?jié)摿�。圖1-3基于比色法檢測PNK活性示意圖。1.2.1.2基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移檢測多核苷酸激酶熒光能量共振轉(zhuǎn)移（Fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET）是指在兩個不同的熒光分子中，當(dāng)一個熒光分子（又稱為供體分子）的熒光光譜與另一個熒光分子（又稱為受體分子）的激發(fā)光譜相重疊，并且兩個分子的距離在10nm范圍以內(nèi)時，供體熒光分子的激發(fā)能誘發(fā)受體分子發(fā)出熒光，同時供體熒光分子自身的熒光強(qiáng)度衰減[31]。近年來，水溶性熒光共軛聚合物在生物傳感領(lǐng)域引起了廣泛關(guān)注。這些熒光聚合物含有大量具有離域電子結(jié)構(gòu)的吸收單元，導(dǎo)致了相當(dāng)高的吸收系數(shù)。熒光共軛聚合物由于其獨(dú)特的光收集和熒光放大特性，已被廣泛用作各種生物分子的FRET傳感平臺的能量供


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