β-半乳糖苷酶（β-gal）作為一個典型的酶,已經(jīng)被證明是一個重要的研究細(xì)胞衰老的生物標(biāo)記物。而目前與衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）是體外和體內(nèi)最廣泛使用的細(xì)胞衰老的生物標(biāo)記物,故實(shí)時監(jiān)測亞細(xì)胞水平的β-gal活性至關(guān)重要。近年來許多研究都主要通過熒光探針在生物體系中進(jìn)行可視化成像來研究細(xì)胞衰老。本研究的主要目的:通過解析β-半乳糖苷酶與熒光探針分子的三維晶體結(jié)構(gòu),闡明其主要相互作用,揭示β-半乳糖苷酶識別熒光探針的結(jié)構(gòu)生物學(xué)基礎(chǔ),為以后熒光探針分子的設(shè)計(jì)和優(yōu)化提供依據(jù)。本論文構(gòu)建了來自大腸桿菌的β-半乳糖苷酶（E.coliβ-gal）“TIM”催化結(jié)構(gòu)域的活性氨基酸Glu537的突變體E537Q的表達(dá)菌株:sumo-β-gal E537Qp ET21a/BL21（DE3）以及通過Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建人源的β-半乳糖苷酶（humanβ-gal）的表達(dá)菌株:humanβ-gal-p Fast Bac/DH10Bac。之后經(jīng)進(jìn)一步表達(dá)提純成功獲得純度大于95%的E.coliβ-gal E537Q蛋白。然后我們通過浸泡法獲得三種經(jīng)篩選的熒光分子（GY1,GY... 

【文章來源】：西北大學(xué)陜西省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：88 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

E.coliβ-半乳糖苷酶的四聚體結(jié)構(gòu)

西北大學(xué)碩士學(xué)位論文4而垂直的對稱軸形成“激活”界面[8]。在每個單體中的活性位點(diǎn)都存在金屬離子Mg2+和Na+，這些金屬離子對酶的功能也很重要[13]。2.E.coliβ-半乳糖苷酶的單體結(jié)構(gòu)圖1.3E.coliβ-半乳糖苷酶的單體結(jié)構(gòu)形成E.coliβ-半乳糖苷酶單體的1023個氨基酸殘基大多數(shù)形成五個明確定義的結(jié)構(gòu)域[11]。這些結(jié)構(gòu)包含果凍卷狀(jelly-rolltypebarrel)的Domain1，具有纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)(fibronectintypeIII-likebarrels)的Domain2和Domain4，由288個殘基形成的β-三明治(β-sandwich)結(jié)構(gòu)的Domain5以及具有中心“TIM桶”結(jié)構(gòu)的Domain3形成（圖1.3）。與所有其他包含“TIM桶”結(jié)構(gòu)域的已知酶一樣，E.coliβ-半乳糖苷酶的活性位點(diǎn)位于該結(jié)構(gòu)域中心的C末端，活性位點(diǎn)形成一個深坑，可很好地進(jìn)入“TIM桶”結(jié)構(gòu)域的核心。另外，活性位點(diǎn)還包括來自同一單體的第一、第五結(jié)構(gòu)域的環(huán)，除了來自同一單體的這些成分外，還有一個回路來自不同單體的結(jié)構(gòu)域2，并通過“激活界面”延伸到相鄰的活性位點(diǎn)。1.2.3E.coliβ-半乳糖苷酶的催化機(jī)制

西北大學(xué)碩士學(xué)位論文6圖1.5E.coliβ-半乳糖苷酶與配體結(jié)合時相互作用的示意圖A：乳糖與E537Q突變體的“淺度”結(jié)合模式(PDBID:1jyn)；B：半乳糖內(nèi)酯與天然酶的“深度”結(jié)合模式(PDBID:1jz7)E.coliβ-半乳糖苷酶與配體的結(jié)合方式有兩種，底物類似物和一種產(chǎn)物（異乳糖）結(jié)合在活性位點(diǎn)的“淺”位，即淺度結(jié)合模式，而中間體、過渡態(tài)類似物和另一種產(chǎn)物（半乳糖）則結(jié)合在“深”位,即深度結(jié)合模式[14]。當(dāng)配體處于淺度結(jié)合時，它與Glu461和Glu537是預(yù)先結(jié)合的，不屬于催化上正確的并置。此時糖苷氧與潛在的酸催化劑之間的距離(6)較大，因此底物需要朝更深的模式移動才能發(fā)生裂解，淺度結(jié)合主要的相互作用為底物平行于Trp999并與其進(jìn)行堆疊交互[14]。其他重要的相互作用主要是與底物半乳糖基部分。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，底物必須移動約1~4深入到活性位點(diǎn)才能開始催化。因?yàn)橹挥性谳^深的位置上，底物才相對于催化殘基(Glu461和Glu537)處于正確的位置，即Glu461接觸糖苷氧，親核試劑Glu537接觸異頭碳中心，形成中間過渡態(tài)。且蛋白殘基與過渡態(tài)的半乳糖基部分的相互作用很重要，尤其是，該部分會與Trp568發(fā)生堆積相互作用，此時2-OH可以直接與Asn460，Glu461和Glu537相互作用。如圖1.5所示，在兩種結(jié)合模式下，半乳糖基6-OH直接配位到活性位點(diǎn)Na+，但Mg2+與配體并沒有直接相互作用。除半乳糖復(fù)合物外，更深層的結(jié)合模式還伴隨著酶構(gòu)象的變化，Phe601旋轉(zhuǎn)且從Domain5開始的794-804環(huán)向著活性位點(diǎn)移動了10。結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)已經(jīng)表明，半乳糖基有兩個重疊但不同的位點(diǎn)，一個淺而一個深，每個位點(diǎn)的酶和底物之間都有特定的氫鍵。相反，在葡萄糖亞位點(diǎn)的結(jié)合相對不清楚，主要是通過與Trp999的堆積相互作用來確定的。這種非特異性結(jié)合與酶對各種糖苷配基的相

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]β-半乳糖苷酶熒光探針的研究進(jìn)展[J]. 李檬,高天初,朱為宏.  中國科學(xué):化學(xué). 2017(08)



本文編號：3402134