發(fā)布時間：2021-09-19 18:41

　　β-半乳糖苷酶（β-gal）作為一個典型的酶,已經(jīng)被證明是一個重要的研究細胞衰老的生物標記物。而目前與衰老相關的β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）是體外和體內(nèi)最廣泛使用的細胞衰老的生物標記物,故實時監(jiān)測亞細胞水平的β-gal活性至關重要。近年來許多研究都主要通過熒光探針在生物體系中進行可視化成像來研究細胞衰老。本研究的主要目的:通過解析β-半乳糖苷酶與熒光探針分子的三維晶體結構,闡明其主要相互作用,揭示β-半乳糖苷酶識別熒光探針的結構生物學基礎,為以后熒光探針分子的設計和優(yōu)化提供依據(jù)。本論文構建了來自大腸桿菌的β-半乳糖苷酶（E.coliβ-gal）“TIM”催化結構域的活性氨基酸Glu537的突變體E537Q的表達菌株:sumo-β-gal E537Qp ET21a/BL21（DE3）以及通過Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)構建人源的β-半乳糖苷酶（humanβ-gal）的表達菌株:humanβ-gal-p Fast Bac/DH10Bac。之后經(jīng)進一步表達提純成功獲得純度大于95%的E.coliβ-gal E537Q蛋白。然后我們通過浸泡法獲得三種經(jīng)篩選的熒光分子（GY1,GY... 

【文章來源】：西北大學陜西省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：88 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

E.coliβ-半乳糖苷酶的四聚體結構

西北大學碩士學位論文4而垂直的對稱軸形成“激活”界面[8]。在每個單體中的活性位點都存在金屬離子Mg2+和Na+，這些金屬離子對酶的功能也很重要[13]。2.E.coliβ-半乳糖苷酶的單體結構圖1.3E.coliβ-半乳糖苷酶的單體結構形成E.coliβ-半乳糖苷酶單體的1023個氨基酸殘基大多數(shù)形成五個明確定義的結構域[11]。這些結構包含果凍卷狀(jelly-rolltypebarrel)的Domain1，具有纖連蛋白III型結構(fibronectintypeIII-likebarrels)的Domain2和Domain4，由288個殘基形成的β-三明治(β-sandwich)結構的Domain5以及具有中心“TIM桶”結構的Domain3形成（圖1.3）。與所有其他包含“TIM桶”結構域的已知酶一樣，E.coliβ-半乳糖苷酶的活性位點位于該結構域中心的C末端，活性位點形成一個深坑，可很好地進入“TIM桶”結構域的核心。另外，活性位點還包括來自同一單體的第一、第五結構域的環(huán)，除了來自同一單體的這些成分外，還有一個回路來自不同單體的結構域2，并通過“激活界面”延伸到相鄰的活性位點。1.2.3E.coliβ-半乳糖苷酶的催化機制

西北大學碩士學位論文6圖1.5E.coliβ-半乳糖苷酶與配體結合時相互作用的示意圖A：乳糖與E537Q突變體的“淺度”結合模式(PDBID:1jyn)；B：半乳糖內(nèi)酯與天然酶的“深度”結合模式(PDBID:1jz7)E.coliβ-半乳糖苷酶與配體的結合方式有兩種，底物類似物和一種產(chǎn)物（異乳糖）結合在活性位點的“淺”位，即淺度結合模式，而中間體、過渡態(tài)類似物和另一種產(chǎn)物（半乳糖）則結合在“深”位,即深度結合模式[14]。當配體處于淺度結合時，它與Glu461和Glu537是預先結合的，不屬于催化上正確的并置。此時糖苷氧與潛在的酸催化劑之間的距離(6)較大，因此底物需要朝更深的模式移動才能發(fā)生裂解，淺度結合主要的相互作用為底物平行于Trp999并與其進行堆疊交互[14]。其他重要的相互作用主要是與底物半乳糖基部分。隨著反應的進行，底物必須移動約1~4深入到活性位點才能開始催化。因為只有在較深的位置上，底物才相對于催化殘基(Glu461和Glu537)處于正確的位置，即Glu461接觸糖苷氧，親核試劑Glu537接觸異頭碳中心，形成中間過渡態(tài)。且蛋白殘基與過渡態(tài)的半乳糖基部分的相互作用很重要，尤其是，該部分會與Trp568發(fā)生堆積相互作用，此時2-OH可以直接與Asn460，Glu461和Glu537相互作用。如圖1.5所示，在兩種結合模式下，半乳糖基6-OH直接配位到活性位點Na+，但Mg2+與配體并沒有直接相互作用。除半乳糖復合物外，更深層的結合模式還伴隨著酶構象的變化，Phe601旋轉且從Domain5開始的794-804環(huán)向著活性位點移動了10。結構數(shù)據(jù)已經(jīng)表明，半乳糖基有兩個重疊但不同的位點，一個淺而一個深，每個位點的酶和底物之間都有特定的氫鍵。相反，在葡萄糖亞位點的結合相對不清楚，主要是通過與Trp999的堆積相互作用來確定的。這種非特異性結合與酶對各種糖苷配基的相

【參考文獻】：
期刊論文
[1]β-半乳糖苷酶熒光探針的研究進展[J]. 李檬,高天初,朱為宏.  中國科學:化學. 2017(08)



本文編號：3402134