本文關(guān)鍵詞：Na_2SeO_3誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡過(guò)程中硒醇和活性氧的檢測(cè)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：硒是人體必需的微量元素之一，與人體許多疾病密切相關(guān)。亞硒酸鈉作為一種抗癌藥物，能夠有效地殺死腫瘤細(xì)胞，且對(duì)正常細(xì)胞的毒性較小。隨著癌癥發(fā)病率的提高，亞硒酸鈉的抗癌功效引起更多的關(guān)注，但其抗癌的具體機(jī)制卻還不清楚。大量研究認(rèn)為，亞硒酸鈉在代謝過(guò)程中，生成的硒醇與氧氣反應(yīng)產(chǎn)生活性氧，引起氧化應(yīng)激從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。但是在以往的研究過(guò)程中，，卻忽略了實(shí)體腫瘤的缺氧微環(huán)境，在常氧的環(huán)境下進(jìn)行了與氧化應(yīng)激相關(guān)的各種信號(hào)通路的研究。因此，我們?cè)诜ρ鯒l件下，利用新的熒光探針重新監(jiān)測(cè)了亞硒酸鈉誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡過(guò)程中硒醇和活性氧的含量變化，觀察細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)變化，試圖在真正的腫瘤微環(huán)境下來(lái)對(duì)亞硒酸鈉的抗癌機(jī)制進(jìn)行研究。 本文綜述了硒醇探針和雙組分同時(shí)檢測(cè)的研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢(shì)，以亞硒酸鈉誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡過(guò)程為細(xì)胞模型，利用金納米粒子和肽鏈設(shè)計(jì)了新型的檢測(cè)硒醇的納米探針，并實(shí)現(xiàn)了在同一激發(fā)下，對(duì)硒醇和活性氧的同時(shí)檢測(cè)。具體工作內(nèi)容主要分為以下三個(gè)方面： 1、設(shè)計(jì)了一種新型的近紅外檢測(cè)硒醇的金納米探針，并進(jìn)行了生物成像分析。本探針是在金納米粒子的表面通過(guò)Au-S鍵組裝上修飾了近紅外染料的肽鏈（N端Cy5.5，C端半胱氨酸裸露巰基），金納米粒子與染料之間發(fā)生FRET，染料的熒光被金猝滅，由于硒醇更強(qiáng)的親核性能，能夠與巰基之間發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，形成更加穩(wěn)定的Au-Se鍵，使連接了Cy5.5的肽鏈被置換下來(lái)，熒光恢復(fù)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)硒醇的特異性檢測(cè)。 該探針的激發(fā)發(fā)射均在近紅外區(qū)，避開(kāi)了生物體自體熒光的干擾，與以往的可見(jiàn)探針相比，具有較大的優(yōu)勢(shì)。首次利用硒醇與納米金之間更易于成鍵的能力來(lái)設(shè)計(jì)探針，生物體內(nèi)含有的一些還原性物質(zhì)、氧化性物質(zhì)、氨基酸、金屬離子等均沒(méi)有干擾，具有較高的選擇性和靈敏度。在0~100μM的濃度范圍內(nèi)，隨著硒醇濃度的增高，熒光增強(qiáng)，并且有很好的線性關(guān)系，線性方程為F=1623.3+170.18[Sec] μM，線性相關(guān)系數(shù)為0.9902。通過(guò)細(xì)胞毒性試驗(yàn)可以看出該金納米探針具有良好的生物相容性和較低的毒性，并且在缺氧的條件下，也能夠很好的檢測(cè)到亞硒酸鈉誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡過(guò)程中硒醇的含量變化。 2、檢測(cè)硒醇的可見(jiàn)金納米探針的設(shè)計(jì)合成及生物應(yīng)用。亞硒酸鈉在人體內(nèi)代謝產(chǎn)生硒醇和活性氧，因此，在乏氧下實(shí)現(xiàn)對(duì)硒醇和活性氧的同時(shí)檢測(cè)，有助于對(duì)亞硒酸鈉抗癌機(jī)制的研究。基于在同一激發(fā)，不同發(fā)射下進(jìn)行雙檢測(cè)的目的，我們利用Au-Se鍵競(jìng)爭(zhēng)取代Au-S鍵，設(shè)計(jì)了一種FAM修飾的波長(zhǎng)匹配的檢測(cè)硒醇的金納米探針，激發(fā)發(fā)射均在可見(jiàn)區(qū)（Ex=490nm, Em=520nm)。之后分別在化學(xué)體系和生物模型中對(duì)探針的性能進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)探針能夠特異性的檢測(cè)硒醇，不受生物體內(nèi)含有的一些還原性物質(zhì)、氧化性物質(zhì)、氨基酸、金屬離子等的干擾，具有較高的選擇性和靈敏度。在0~100μM的濃度范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度隨硒醇的濃度增加，有很好的線性關(guān)系，線性方程為F=2729.79+308.65[Sec] μM，線性相關(guān)系數(shù)為0.9959。該金納米探針具有良好的生物相容性和較低的毒性，能夠在缺氧的條件下，檢測(cè)亞硒酸鈉誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡過(guò)程中硒醇的含量變化。 3、同一激發(fā)下，硒醇與H2O2的同時(shí)檢測(cè)。在上一章的研究基礎(chǔ)上，選擇合成了一種以反花菁染料為熒光母體，苯硼酸酯為響應(yīng)基團(tuán)的特異性檢測(cè)H2O2的小分子探針（QCy7)，該探針與H2O2反應(yīng)后的光譜具有雙激發(fā)、單發(fā)射的特點(diǎn)（Ex1=490nm，Ex2=560nm，Em=710nm)，與上一章中的檢測(cè)硒醇可見(jiàn)探針激發(fā)光譜重疊，發(fā)射光譜分離，在化學(xué)體系很好地實(shí)現(xiàn)同一激發(fā)下的雙檢測(cè)，兩種探針之間相互不干擾。在常氧/乏氧條件下，在亞硒酸鈉抗癌藥物的誘導(dǎo)下，檢測(cè)了肝癌細(xì)胞中硒醇和活性氧的變化情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在常氧條件下，隨著亞硒酸鈉誘導(dǎo)時(shí)間的增加，細(xì)胞內(nèi)的硒醇和H2O2含量均明顯上升；乏氧時(shí)，隨著亞硒酸鈉誘導(dǎo)時(shí)間的增加，細(xì)胞內(nèi)的硒醇含量增加，H2O2含量則無(wú)明顯變化。推測(cè)原因是因?yàn)樵诜ρ醯哪[瘤微環(huán)境下，氧氣的含量較低，無(wú)法與硒醇作用產(chǎn)生更多的活性氧。實(shí)驗(yàn)結(jié)果在一定程度上說(shuō)明了亞硒酸鈉誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，不是由一個(gè)氧化應(yīng)激過(guò)程，而是由細(xì)胞內(nèi)硒醇含量過(guò)高引起的還原脅迫造成的，這為以后研究亞硒酸鈉的抗癌機(jī)制，提供了一個(gè)新的思路。
【關(guān)鍵詞】：亞硒酸鈉 硒醇 H2O2 金納米探針 還原脅迫
【學(xué)位授予單位】：山東師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R73-36;O657.3
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 第一章 緒論11-31
• 1、硒與癌癥11-16
• 1.1 硒的生理作用11-12
• 1.2 亞硒酸鈉作為一種具有前景的抗腫瘤藥物12
• 1.3 亞硒酸鈉氧化應(yīng)激抗癌機(jī)制的研究12-14
• 1.4 硒醇的熒光檢測(cè)進(jìn)展14-16
• 2、納米金概述16-20
• 2.1 納米金的特性16-17
• 2.2 納米金在生物傳感上的應(yīng)用17-20
• 3、多組分同時(shí)檢測(cè)20-22
• 3.1 多組分同時(shí)檢測(cè)的意義20
• 3.2 多組分同時(shí)檢測(cè)研究現(xiàn)狀20-22
• 4、論文的選題背景和研究意義22-25
• 參考文獻(xiàn)25-31
• 第二章 硒醇近紅外金納米探針的設(shè)計(jì)合成及生物成像31-54
• 摘要31
• 1、引言31-33
• 2、實(shí)驗(yàn)部分33-38
• 2.1 儀器與試劑33
• 2.2 肽鏈的合成33-34
• 2.3 金納米粒子的制備34
• 2.4 納米探針（Cy5.5-peptide-AuNPs）的制備34
• 2.5 納米探針上組裝的肽鏈數(shù)量的確定34-35
• 2.6 納米探針的化學(xué)體系分析35-36
• 2.6.1 硒醇的配制方法35
• 2.6.2 探針熒光光譜的測(cè)定35-36
• 2.6.3 探針?lè)磻?yīng)動(dòng)力學(xué)36
• 2.6.4 探針與硒醇的響應(yīng)36
• 2.6.5 探針的選擇性測(cè)定36
• 2.7 納米探針的生物體系分析36-38
• 2.7.1 細(xì)胞培養(yǎng)36
• 2.7.2 MTT 實(shí)驗(yàn)36-37
• 2.7.3 納米探針的抗光漂白實(shí)驗(yàn)37
• 2.7.4 硒醇的熒光共聚焦成像37
• 2.7.5 Na_2SeO_3的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)37
• 2.7.6 在乏氧下研究 Na_2SeO_3誘導(dǎo) HepG_2 細(xì)胞凋亡過(guò)程中硒醇含量的變化37-38
• 3、結(jié)果與討論38-49
• 3.1 金納米粒子及納米金探針的合成及表征38-39
• 3.2 納米金探針的肽鏈負(fù)載量39-40
• 3.3 納米金探針的光譜性質(zhì)40
• 3.4 納米金探針與硒醇反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)40-41
• 3.5 pH對(duì)納米金探針?lè)磻?yīng)的影響41-42
• 3.6 納米金探針對(duì)硒醇的熒光響應(yīng)42
• 3.7 納米金探針的選擇性評(píng)價(jià)42-45
• 3.8 納米探針的細(xì)胞毒性試驗(yàn)（MTT）45-46
• 3.9 納米探針的抗光漂白實(shí)驗(yàn)46
• 3.10 HepG_2 細(xì)胞中硒醇的熒光成像46-47
• 3.11 Na_2SeO_3的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)47-48
• 3.12 在乏氧下研究 Na_2SeO_3誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡過(guò)程中硒醇含量的變化48-49
• 3.12.1 不同濃度 Na_2SeO_3誘導(dǎo) HepG_2 細(xì)胞48-49
• 3.12.2 Na_2SeO_3誘導(dǎo) HepG_2 細(xì)胞不同時(shí)間49
• 4、本章小結(jié)49-51
• 參考文獻(xiàn)51-54
• 第三章 硒醇可見(jiàn)金納米探針的設(shè)計(jì)合成及生物應(yīng)用54-73
• 摘要54
• 1、引言54-55
• 2、實(shí)驗(yàn)部分55-60
• 2.1 儀器與試劑55-56
• 2.2 肽鏈的合成56
• 2.3 金納米粒子的制備56
• 2.4 納米探針（5-FAM-peptide-AuNPs）的制備56-57
• 2.5 納米探針上組裝的肽鏈數(shù)量的確定57
• 2.6 納米探針的化學(xué)體系分析57-58
• 2.6.1 待測(cè)物的配制方法57
• 2.6.2 探針熒光光譜的測(cè)定57-58
• 2.6.3 探針?lè)磻?yīng)動(dòng)力學(xué)58
• 2.6.4 探針與硒醇的響應(yīng)58
• 2.6.5 探針的選擇性測(cè)定58
• 2.7 納米探針的生物體系分析58-60
• 2.7.1 細(xì)胞培養(yǎng)58
• 2.7.2 MTT 實(shí)驗(yàn)58-59
• 2.7.3 納米探針的抗光漂白實(shí)驗(yàn)59
• 2.7.4 HepG_2 細(xì)胞中硒醇的熒光共聚焦成像59
• 2.7.5 在乏氧下研究 Na_2SeO_3誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡過(guò)程中硒醇含量的變化59-60
• 3、結(jié)果與討論60-70
• 3.1 金納米粒子及納米金探針的合成及表征60
• 3.2 納米金探針的肽鏈負(fù)載量60-61
• 3.3 納米金探針的光譜性質(zhì)61-62
• 3.4 納米金探針與硒醇反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)62
• 3.5 pH對(duì)納米金探針?lè)磻?yīng)的影響62-63
• 3.6 納米金探針對(duì)硒醇的熒光響應(yīng)63-64
• 3.7 納米金探針的選擇性評(píng)價(jià)64-66
• 3.8 納米探針的細(xì)胞毒性試驗(yàn)（MTT）66-67
• 3.9 納米探針的抗光漂白實(shí)驗(yàn)67
• 3.10 HepG_2 細(xì)胞中硒醇的熒光成像67-68
• 3.11 在乏氧下研究 Na_2SeO_3誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡過(guò)程中硒醇含量的變化68-70
• 3.11.1 不同濃度 Na_2SeO_3誘導(dǎo) HepG_2 細(xì)胞68-69
• 3.11.2 Na_2SeO_3誘導(dǎo) HepG_2 細(xì)胞不同時(shí)間69-70
• 4、結(jié)論70-71
• 參考文獻(xiàn)71-73
• 第四章 亞硒酸鈉誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡過(guò)程中硒醇和 H2O2的同時(shí)檢測(cè)（同一激發(fā)）73-91
• 摘要73
• 1、引言73-74
• 2、實(shí)驗(yàn)部分74-79
• 2.1 儀器與試劑74-75
• 2.2 反花菁探針 QCy7 的合成路線[1]75
• 2.3 反花菁熒光探針 QCy7 的合成與表征75-76
• 2.4 反花菁熒光探針 QCy7 的化學(xué)體系分析76-77
• 2.4.0 探針儲(chǔ)備液的配制方法76
• 2.4.1 反花菁熒光探針 QCy7 的光譜性質(zhì)76-77
• 2.4.2 反花菁熒光探針 QCy7 與 H2O2的響應(yīng)77
• 2.4.3 硒醇對(duì)反花菁熒光探針 QCy7 的干擾測(cè)定77
• 2.5 化學(xué)體系中硒醇與 H2O2的同時(shí)檢測(cè)77-78
• 2.5.1 兩種探針的光譜疊加77
• 2.5.2 兩種探針的混合液對(duì)硒醇的響應(yīng)77-78
• 2.5.3 兩種探針的混合液對(duì) H2O2的響應(yīng)78
• 2.6 兩種探針在 HepG_2 細(xì)胞內(nèi)的共成像78
• 2.7 Na_2SeO_3誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡過(guò)程中硒醇和 H2O2的雙檢測(cè)78-79
• 2.7.1 常氧條件下 Na_2SeO_3誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡過(guò)程中硒醇和 H2O2的雙檢測(cè)78
• 2.7.2 乏氧條件下 Na_2SeO_3誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡過(guò)程中硒醇和 H2O2的雙檢測(cè)78-79
• 3、結(jié)果與討論79-87
• 3.1 反花菁熒光探針 QCy7 反應(yīng)后光譜性質(zhì)79
• 3.2 反花菁熒光探針 QCy7 與 H2O2的響應(yīng)79-80
• 3.3 硒醇對(duì)反花菁熒光探針 QCy7 的干擾測(cè)定80-81
• 3.4 化學(xué)體系中硒醇與 H2O2的同時(shí)檢測(cè)81-83
• 3.4.1 兩種探針的光譜疊加81
• 3.4.2 兩種探針的混合液對(duì)硒醇的響應(yīng)81-82
• 3.4.3 兩種探針的混合液對(duì) H2O2的響應(yīng)82-83
• 3.5 兩種探針在細(xì)胞內(nèi)的共成像83-84
• 3.6 Na_2SeO_3誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡過(guò)程中硒醇和 H2O2的同時(shí)檢測(cè)84-87
• 3.6.1 常氧條件下 Na_2SeO_3誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡過(guò)程中硒醇和 H2O2的同時(shí)檢測(cè)84-85
• 3.6.2 乏氧條件下 Na_2SeO_3誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡過(guò)程中硒醇和 H2O2的同時(shí)檢測(cè)85-87
• 4、結(jié)論87-88
• 參考文獻(xiàn)88-91
• 附圖：肽鏈及合成產(chǎn)物譜圖91-95
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文和參與的課題95-96
• 致謝96

【共引文獻(xiàn)】

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6 陳祥國(guó);扇貝多肽對(duì)紫外線誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞凋亡的影響[D];青島大學(xué);2003年

7 劉潔薇;甲基硒酸對(duì)人高轉(zhuǎn)移大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株L9981凋亡和體外侵襲的影響及分子機(jī)制研究[D];四川大學(xué);2006年

8 何曉麗;光合細(xì)菌對(duì)雞腸道菌群多樣性的影響及富硒顆粒劑的初步研究[D];西南大學(xué);2008年

9 印宏緋;發(fā)芽糙米為主要原料的酵母富硒培養(yǎng)技術(shù)與飲料開(kāi)發(fā)[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

10 陳明濤;小鼠硒蓄積性毒性試驗(yàn)及其殘留測(cè)定研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

  本文關(guān)鍵詞：Na_2SeO_3誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡過(guò)程中硒醇和活性氧的檢測(cè)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：334903