本文關(guān)鍵詞：Na_2SeO_3誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡過程中硒醇和活性氧的檢測，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：硒是人體必需的微量元素之一，與人體許多疾病密切相關(guān)。亞硒酸鈉作為一種抗癌藥物，能夠有效地殺死腫瘤細胞，且對正常細胞的毒性較小。隨著癌癥發(fā)病率的提高，亞硒酸鈉的抗癌功效引起更多的關(guān)注，但其抗癌的具體機制卻還不清楚。大量研究認為，亞硒酸鈉在代謝過程中，生成的硒醇與氧氣反應(yīng)產(chǎn)生活性氧，引起氧化應(yīng)激從而導(dǎo)致腫瘤細胞死亡。但是在以往的研究過程中，，卻忽略了實體腫瘤的缺氧微環(huán)境，在常氧的環(huán)境下進行了與氧化應(yīng)激相關(guān)的各種信號通路的研究。因此，我們在乏氧條件下，利用新的熒光探針重新監(jiān)測了亞硒酸鈉誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡過程中硒醇和活性氧的含量變化，觀察細胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)變化，試圖在真正的腫瘤微環(huán)境下來對亞硒酸鈉的抗癌機制進行研究。 本文綜述了硒醇探針和雙組分同時檢測的研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢，以亞硒酸鈉誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡過程為細胞模型，利用金納米粒子和肽鏈設(shè)計了新型的檢測硒醇的納米探針，并實現(xiàn)了在同一激發(fā)下，對硒醇和活性氧的同時檢測。具體工作內(nèi)容主要分為以下三個方面： 1、設(shè)計了一種新型的近紅外檢測硒醇的金納米探針，并進行了生物成像分析。本探針是在金納米粒子的表面通過Au-S鍵組裝上修飾了近紅外染料的肽鏈（N端Cy5.5，C端半胱氨酸裸露巰基），金納米粒子與染料之間發(fā)生FRET，染料的熒光被金猝滅，由于硒醇更強的親核性能，能夠與巰基之間發(fā)生競爭反應(yīng)，形成更加穩(wěn)定的Au-Se鍵，使連接了Cy5.5的肽鏈被置換下來，熒光恢復(fù)，從而實現(xiàn)對硒醇的特異性檢測。 該探針的激發(fā)發(fā)射均在近紅外區(qū)，避開了生物體自體熒光的干擾，與以往的可見探針相比，具有較大的優(yōu)勢。首次利用硒醇與納米金之間更易于成鍵的能力來設(shè)計探針，生物體內(nèi)含有的一些還原性物質(zhì)、氧化性物質(zhì)、氨基酸、金屬離子等均沒有干擾，具有較高的選擇性和靈敏度。在0~100μM的濃度范圍內(nèi)，隨著硒醇濃度的增高，熒光增強，并且有很好的線性關(guān)系，線性方程為F=1623.3+170.18[Sec] μM，線性相關(guān)系數(shù)為0.9902。通過細胞毒性試驗可以看出該金納米探針具有良好的生物相容性和較低的毒性，并且在缺氧的條件下，也能夠很好的檢測到亞硒酸鈉誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡過程中硒醇的含量變化。 2、檢測硒醇的可見金納米探針的設(shè)計合成及生物應(yīng)用。亞硒酸鈉在人體內(nèi)代謝產(chǎn)生硒醇和活性氧，因此，在乏氧下實現(xiàn)對硒醇和活性氧的同時檢測，有助于對亞硒酸鈉抗癌機制的研究。基于在同一激發(fā)，不同發(fā)射下進行雙檢測的目的，我們利用Au-Se鍵競爭取代Au-S鍵，設(shè)計了一種FAM修飾的波長匹配的檢測硒醇的金納米探針，激發(fā)發(fā)射均在可見區(qū)（Ex=490nm, Em=520nm)。之后分別在化學(xué)體系和生物模型中對探針的性能進行分析，發(fā)現(xiàn)探針能夠特異性的檢測硒醇，不受生物體內(nèi)含有的一些還原性物質(zhì)、氧化性物質(zhì)、氨基酸、金屬離子等的干擾，具有較高的選擇性和靈敏度。在0~100μM的濃度范圍內(nèi)，熒光強度隨硒醇的濃度增加，有很好的線性關(guān)系，線性方程為F=2729.79+308.65[Sec] μM，線性相關(guān)系數(shù)為0.9959。該金納米探針具有良好的生物相容性和較低的毒性，能夠在缺氧的條件下，檢測亞硒酸鈉誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡過程中硒醇的含量變化。 3、同一激發(fā)下，硒醇與H2O2的同時檢測。在上一章的研究基礎(chǔ)上，選擇合成了一種以反花菁染料為熒光母體，苯硼酸酯為響應(yīng)基團的特異性檢測H2O2的小分子探針（QCy7)，該探針與H2O2反應(yīng)后的光譜具有雙激發(fā)、單發(fā)射的特點（Ex1=490nm，Ex2=560nm，Em=710nm)，與上一章中的檢測硒醇可見探針激發(fā)光譜重疊，發(fā)射光譜分離，在化學(xué)體系很好地實現(xiàn)同一激發(fā)下的雙檢測，兩種探針之間相互不干擾。在常氧/乏氧條件下，在亞硒酸鈉抗癌藥物的誘導(dǎo)下，檢測了肝癌細胞中硒醇和活性氧的變化情況。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在常氧條件下，隨著亞硒酸鈉誘導(dǎo)時間的增加，細胞內(nèi)的硒醇和H2O2含量均明顯上升；乏氧時，隨著亞硒酸鈉誘導(dǎo)時間的增加，細胞內(nèi)的硒醇含量增加，H2O2含量則無明顯變化。推測原因是因為在乏氧的腫瘤微環(huán)境下，氧氣的含量較低，無法與硒醇作用產(chǎn)生更多的活性氧。實驗結(jié)果在一定程度上說明了亞硒酸鈉誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡，不是由一個氧化應(yīng)激過程，而是由細胞內(nèi)硒醇含量過高引起的還原脅迫造成的，這為以后研究亞硒酸鈉的抗癌機制，提供了一個新的思路。
【關(guān)鍵詞】：亞硒酸鈉 硒醇 H2O2 金納米探針 還原脅迫
【學(xué)位授予單位】：山東師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R73-36;O657.3
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 第一章 緒論11-31
• 1、硒與癌癥11-16
• 1.1 硒的生理作用11-12
• 1.2 亞硒酸鈉作為一種具有前景的抗腫瘤藥物12
• 1.3 亞硒酸鈉氧化應(yīng)激抗癌機制的研究12-14
• 1.4 硒醇的熒光檢測進展14-16
• 2、納米金概述16-20
• 2.1 納米金的特性16-17
• 2.2 納米金在生物傳感上的應(yīng)用17-20
• 3、多組分同時檢測20-22
• 3.1 多組分同時檢測的意義20
• 3.2 多組分同時檢測研究現(xiàn)狀20-22
• 4、論文的選題背景和研究意義22-25
• 參考文獻25-31
• 第二章 硒醇近紅外金納米探針的設(shè)計合成及生物成像31-54
• 摘要31
• 1、引言31-33
• 2、實驗部分33-38
• 2.1 儀器與試劑33
• 2.2 肽鏈的合成33-34
• 2.3 金納米粒子的制備34
• 2.4 納米探針（Cy5.5-peptide-AuNPs）的制備34
• 2.5 納米探針上組裝的肽鏈數(shù)量的確定34-35
• 2.6 納米探針的化學(xué)體系分析35-36
• 2.6.1 硒醇的配制方法35
• 2.6.2 探針熒光光譜的測定35-36
• 2.6.3 探針反應(yīng)動力學(xué)36
• 2.6.4 探針與硒醇的響應(yīng)36
• 2.6.5 探針的選擇性測定36
• 2.7 納米探針的生物體系分析36-38
• 2.7.1 細胞培養(yǎng)36
• 2.7.2 MTT 實驗36-37
• 2.7.3 納米探針的抗光漂白實驗37
• 2.7.4 硒醇的熒光共聚焦成像37
• 2.7.5 Na_2SeO_3的細胞毒性實驗37
• 2.7.6 在乏氧下研究 Na_2SeO_3誘導(dǎo) HepG_2 細胞凋亡過程中硒醇含量的變化37-38
• 3、結(jié)果與討論38-49
• 3.1 金納米粒子及納米金探針的合成及表征38-39
• 3.2 納米金探針的肽鏈負載量39-40
• 3.3 納米金探針的光譜性質(zhì)40
• 3.4 納米金探針與硒醇反應(yīng)的動力學(xué)40-41
• 3.5 pH對納米金探針反應(yīng)的影響41-42
• 3.6 納米金探針對硒醇的熒光響應(yīng)42
• 3.7 納米金探針的選擇性評價42-45
• 3.8 納米探針的細胞毒性試驗（MTT）45-46
• 3.9 納米探針的抗光漂白實驗46
• 3.10 HepG_2 細胞中硒醇的熒光成像46-47
• 3.11 Na_2SeO_3的細胞毒性實驗47-48
• 3.12 在乏氧下研究 Na_2SeO_3誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡過程中硒醇含量的變化48-49
• 3.12.1 不同濃度 Na_2SeO_3誘導(dǎo) HepG_2 細胞48-49
• 3.12.2 Na_2SeO_3誘導(dǎo) HepG_2 細胞不同時間49
• 4、本章小結(jié)49-51
• 參考文獻51-54
• 第三章 硒醇可見金納米探針的設(shè)計合成及生物應(yīng)用54-73
• 摘要54
• 1、引言54-55
• 2、實驗部分55-60
• 2.1 儀器與試劑55-56
• 2.2 肽鏈的合成56
• 2.3 金納米粒子的制備56
• 2.4 納米探針（5-FAM-peptide-AuNPs）的制備56-57
• 2.5 納米探針上組裝的肽鏈數(shù)量的確定57
• 2.6 納米探針的化學(xué)體系分析57-58
• 2.6.1 待測物的配制方法57
• 2.6.2 探針熒光光譜的測定57-58
• 2.6.3 探針反應(yīng)動力學(xué)58
• 2.6.4 探針與硒醇的響應(yīng)58
• 2.6.5 探針的選擇性測定58
• 2.7 納米探針的生物體系分析58-60
• 2.7.1 細胞培養(yǎng)58
• 2.7.2 MTT 實驗58-59
• 2.7.3 納米探針的抗光漂白實驗59
• 2.7.4 HepG_2 細胞中硒醇的熒光共聚焦成像59
• 2.7.5 在乏氧下研究 Na_2SeO_3誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡過程中硒醇含量的變化59-60
• 3、結(jié)果與討論60-70
• 3.1 金納米粒子及納米金探針的合成及表征60
• 3.2 納米金探針的肽鏈負載量60-61
• 3.3 納米金探針的光譜性質(zhì)61-62
• 3.4 納米金探針與硒醇反應(yīng)的動力學(xué)62
• 3.5 pH對納米金探針反應(yīng)的影響62-63
• 3.6 納米金探針對硒醇的熒光響應(yīng)63-64
• 3.7 納米金探針的選擇性評價64-66
• 3.8 納米探針的細胞毒性試驗（MTT）66-67
• 3.9 納米探針的抗光漂白實驗67
• 3.10 HepG_2 細胞中硒醇的熒光成像67-68
• 3.11 在乏氧下研究 Na_2SeO_3誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡過程中硒醇含量的變化68-70
• 3.11.1 不同濃度 Na_2SeO_3誘導(dǎo) HepG_2 細胞68-69
• 3.11.2 Na_2SeO_3誘導(dǎo) HepG_2 細胞不同時間69-70
• 4、結(jié)論70-71
• 參考文獻71-73
• 第四章 亞硒酸鈉誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡過程中硒醇和 H2O2的同時檢測（同一激發(fā)）73-91
• 摘要73
• 1、引言73-74
• 2、實驗部分74-79
• 2.1 儀器與試劑74-75
• 2.2 反花菁探針 QCy7 的合成路線[1]75
• 2.3 反花菁熒光探針 QCy7 的合成與表征75-76
• 2.4 反花菁熒光探針 QCy7 的化學(xué)體系分析76-77
• 2.4.0 探針儲備液的配制方法76
• 2.4.1 反花菁熒光探針 QCy7 的光譜性質(zhì)76-77
• 2.4.2 反花菁熒光探針 QCy7 與 H2O2的響應(yīng)77
• 2.4.3 硒醇對反花菁熒光探針 QCy7 的干擾測定77
• 2.5 化學(xué)體系中硒醇與 H2O2的同時檢測77-78
• 2.5.1 兩種探針的光譜疊加77
• 2.5.2 兩種探針的混合液對硒醇的響應(yīng)77-78
• 2.5.3 兩種探針的混合液對 H2O2的響應(yīng)78
• 2.6 兩種探針在 HepG_2 細胞內(nèi)的共成像78
• 2.7 Na_2SeO_3誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡過程中硒醇和 H2O2的雙檢測78-79
• 2.7.1 常氧條件下 Na_2SeO_3誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡過程中硒醇和 H2O2的雙檢測78
• 2.7.2 乏氧條件下 Na_2SeO_3誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡過程中硒醇和 H2O2的雙檢測78-79
• 3、結(jié)果與討論79-87
• 3.1 反花菁熒光探針 QCy7 反應(yīng)后光譜性質(zhì)79
• 3.2 反花菁熒光探針 QCy7 與 H2O2的響應(yīng)79-80
• 3.3 硒醇對反花菁熒光探針 QCy7 的干擾測定80-81
• 3.4 化學(xué)體系中硒醇與 H2O2的同時檢測81-83
• 3.4.1 兩種探針的光譜疊加81
• 3.4.2 兩種探針的混合液對硒醇的響應(yīng)81-82
• 3.4.3 兩種探針的混合液對 H2O2的響應(yīng)82-83
• 3.5 兩種探針在細胞內(nèi)的共成像83-84
• 3.6 Na_2SeO_3誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡過程中硒醇和 H2O2的同時檢測84-87
• 3.6.1 常氧條件下 Na_2SeO_3誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡過程中硒醇和 H2O2的同時檢測84-85
• 3.6.2 乏氧條件下 Na_2SeO_3誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡過程中硒醇和 H2O2的同時檢測85-87
• 4、結(jié)論87-88
• 參考文獻88-91
• 附圖：肽鏈及合成產(chǎn)物譜圖91-95
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文和參與的課題95-96
• 致謝96

【共引文獻】

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