菜豆環(huán)氧化物水解酶1和2（Pv EH1、Pv EH2）能夠動(dòng)力學(xué)拆分外消旋鄰甲基苯基縮水甘油醚（rac-o MGE）,從而保留（R）-o MGE�；趯�(duì)Pv EH1和Pv EH2結(jié)構(gòu)的同源模擬和分析,發(fā)現(xiàn)二者分子中的蓋子環(huán)差異較大,故本文選擇蓋子環(huán)作為研究目標(biāo)。經(jīng)融合聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（FPCR）,獲得了Pv EH2的蓋子環(huán)區(qū)域被Pv EH1對(duì)應(yīng)區(qū)域替換的雜合酶Pv2Pv1。用全細(xì)胞酶E. coli/pv2pv1催化rac-o MGE,當(dāng)（S）-o MGE剛好水解完全時(shí),產(chǎn)物（S）-3-鄰甲苯基-1,2-丙二醇（（S）-o TPD）的eep由Pv EH2的58.3%提高至75.5%。為進(jìn)一步提高酶的性質(zhì),在Pv2Pv1中選取11個(gè)氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行丙氨酸（A）突變,獲得最優(yōu)突變子E. coli/pv2pv1K176A,活性為E. coli/pv2pv1（4.2U/g）的2.1倍,且當(dāng)S構(gòu)型的底物剛好完全水解時(shí),（S）-o TPD的eep進(jìn)一步提高為80.3%。分子對(duì)接分析發(fā)現(xiàn),蓋子環(huán)替換和K176位點(diǎn)突變?yōu)锳,均使（R）-o MGE環(huán)氧環(huán)中的Cα更易受到酶中D101位點(diǎn)的攻擊。利用E. col... 

【文章來(lái)源】：化工進(jìn)展. 2020,39(07)北大核心EICSCD

【文章頁(yè)數(shù)】：7 頁(yè)

【部分圖文】：

200mg/mL E.coli/pv2pv1K176A水解150mmol/L rac-o MGE的進(jìn)程圖

將Pv2Pv1和另外4種植物來(lái)源的EH的一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源序列比對(duì)，找出非保守氨基酸（同源性≤60%）。根據(jù)1.3節(jié)方法對(duì)Pv2Pv1同源建模，再通過(guò)AutoDock4.2軟件（http://autodock.scripps.edu）進(jìn)行分子對(duì)接，用PyMOL找出距離(R)-o MGE 8?以內(nèi)的非保守氨基酸，并通過(guò)兩輪全質(zhì)粒PCR將這些氨基酸突變?yōu)楸彼幔ˋ）。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)突變引物[10]。一輪PCR所用的上游引物為設(shè)計(jì)的突變引物，下游引物為通用引物pColdⅡ-R，預(yù)變性95℃，4min；變性98℃，10s；退火55℃，5s；延伸72℃，1min；從變性到延伸循環(huán)30次，最后充分延伸，72℃，10min。二輪PCR以一輪PCR產(chǎn)物為引物，全質(zhì)粒為模板，除延伸時(shí)間變?yōu)?min，其他條件同第一輪。產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶Dpn I消化后導(dǎo)入E.coli BL21(DE3），培養(yǎng)12h后對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，并對(duì)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果正確的轉(zhuǎn)化子命名為E.coli/pv2pv1突變位點(diǎn)。1.7 分子對(duì)接分析

Pv EH1和Pv EH2的三維模擬結(jié)構(gòu)比對(duì)

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]環(huán)氧水解酶的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)及新酶開(kāi)發(fā)[J]. 孔旭東,郁惠蕾,周佳海,許建和.  生物加工過(guò)程. 2013(01)

碩士論文
[1]菜豆環(huán)氧化物水解酶PvEH1的催化性質(zhì)及分子改造研究[D]. 葉慧華.江南大學(xué) 2017
[2]綠豆環(huán)氧水解酶VrEH2催化性質(zhì)研究及分子改造的初步探索[D]. 吳燕雯.華東理工大學(xué) 2015
[3]綠豆環(huán)氧水解酶基因克隆、表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)表征[D]. 賀婉紅.華東理工大學(xué) 2011



本文編號(hào)：3100369