發(fā)布時(shí)間：2021-03-24 23:14

　　水稻,作為重要的糧食作物,是全球超過(guò)一半以上人口生存的食物來(lái)源,深入了解水稻生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程及調(diào)控具有重要的意義。結(jié)合目前多維液相色譜分析植物蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展趨勢(shì),本論文建立二維液相色譜和三維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù),以灌漿期的水稻葉片為實(shí)驗(yàn)材料,通過(guò)優(yōu)化多維液相色譜的流動(dòng)相酸堿度及餾分收集數(shù)目等參數(shù),旨在建立正交性高、分離度好的多維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)分析水稻葉片蛋白質(zhì)組學(xué)。實(shí)驗(yàn)主要研究成果包括如下:1.本實(shí)驗(yàn)建立了離線親水作用-反相二維液相色譜結(jié)合餾分收集技術(shù)分析水稻葉片蛋白質(zhì)。通過(guò)考察親水作用色譜和反相色譜流動(dòng)相的酸堿度對(duì)系統(tǒng)正交性的影響,得到如下結(jié)論:親水作用色譜（pH 9.3）和反相色譜（pH 3.3）的條件下結(jié)合可實(shí)現(xiàn)較好正交性R²=0.34113,并且該方法在實(shí)際水稻葉片蛋白質(zhì)分析中也表現(xiàn)出較好的正交性和分離能力。2.分別優(yōu)化了二維液相色譜系統(tǒng)中餾分收集數(shù)目和一維液相色譜粗肽段上樣量等參數(shù)。實(shí)驗(yàn)從鑒定蛋白質(zhì)數(shù)目、蛋白物理化學(xué)性質(zhì)等方面考察了餾分收集數(shù)目（12組、22組和42組）和一維液相色譜粗肽段上樣量（2 mg、4 mg和6 mg）對(duì)水稻葉片蛋白質(zhì)鑒定數(shù)目... 

【文章來(lái)源】：浙江工業(yè)大學(xué)浙江省

【文章頁(yè)數(shù)】：89 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

離線方式的多維液相色譜系統(tǒng)

圖 2.1 22 組餾分收集組合示意圖Fig. 2.1 Scheme of 22 concatenation strategy第二維納升液相色譜系統(tǒng)采用 Thermo EASY 1000 Nanoflow 液相色維液相色譜條件：Acclaim PepMap RSLC (50 μm × 15 cm, 2 μm) 色譜cclaim PepMap 100 (70 μm × 2 cm，3 μm) Trap 柱；流動(dòng)相 A：0.1%甲酸酸乙腈；流速：0.3 μL/min；進(jìn)樣體積：2 μL。梯度洗脫如下：4%–8%%–30% B，102 min；30%–90% B，10 min；90% B，4 min。質(zhì)譜鑒定利用 Thermo LTQ 線性離子阱質(zhì)譜儀，質(zhì)譜條件如下：N子掃描方式，設(shè)置離子傳輸毛細(xì)管溫度為 300°C，電噴霧電壓：1.9 撞能量為 35%。數(shù)據(jù)依賴模式對(duì) MS 和 MS/MS 進(jìn)行圖譜信息掃描，掃描 (m/z 300–2000)，全掃描中豐度最高的 10 個(gè)離子峰進(jìn)行 MS/M排除 (dynamic exclusion) 設(shè)置為：重復(fù)次數(shù)為 1 次，動(dòng)態(tài)排除時(shí)間

流動(dòng)相的酸堿度。在反相色譜流動(dòng)相確定為酸性條件的基礎(chǔ)上，如圖 2.2 (2D 和 2E) 所示：隨親水作用色譜 pH 從堿性降低到中性，21 種標(biāo)準(zhǔn)肽段在二維液相色譜系統(tǒng)的正交性幾乎沒(méi)有影響; 但當(dāng)親水作用色譜 pH 從中性降低到酸性圖 2.2 (2E 和 2F)，二液相色譜對(duì)肽段的保留行為上表現(xiàn)出明顯的差異，校正保留時(shí)間線性擬合系數(shù)從0.59887 降低到 0.34113。以肽段 2 和 21 為例, 親水性肽段 2 (GRAVY = –1.625) HILIC 色譜柱到 RP 色譜柱的保留時(shí)間從 50 min 縮短到 14 min；疏水性肽段 21(GRAVY = 0.503) 在兩維色譜的保留時(shí)間從 25 min 延長(zhǎng)到 116 min。綜上所述，p9.3 和 pH 3.3 分別被選擇為親水作用色譜和反相色譜的流動(dòng)相酸堿度。此外，反相色譜因分離效率高、流動(dòng)相與質(zhì)譜兼容等優(yōu)點(diǎn)被前人廣泛的應(yīng)用于二維液相色譜系統(tǒng)的最后一維[67,59]，因此我們選擇親水作用色譜和反相色譜分別作為二維液相色譜系統(tǒng)的第一維和第二維。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
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