細胞中化學修飾蛋白及生物大分子相互作用的核磁共振研究
發(fā)布時間：2021-03-20 10:49
細胞是生命的基本單位,也是生物大分子發(fā)揮生物功能的主要場所。細胞的環(huán)境極其復雜,它內部的體積排阻和化學弱相互作用時刻影響著生物大分子的狀態(tài)變化和功能發(fā)揮。細胞內核磁共振（In-cellNMR）可以在活細胞內獲得原子水平分辨的生物大分子結構動態(tài)信息,幫助人們了解細胞環(huán)境對于生物大分子結構和功能的影響。本文主要運用In-cell NMR方法,使用19F作為生物大分子的原子探針,對細胞內的蛋白質化學修飾、蛋白質相互作用以及核酸G-四鏈體穩(wěn)定性及相互作用展開研究,具體內容如下:In-cell NMR方法研究細胞內α-突觸核蛋白的磷酸化修飾及其降解蛋白質在細胞內會發(fā)生廣泛的化學修飾,磷酸化是其中一種十分常見且重要的修飾類型。現階段,在活細胞內對蛋白質磷酸化進行直接、實時的觀測仍然存在困難。本文通過In-cell NMR方法實現了細胞內蛋白質磷酸化的實時監(jiān)測,并開展磷酸化修飾對蛋白質穩(wěn)定性影響的研究。通過選用帕金森癥相關的129位磷酸化α-突觸核蛋白作為研究模型,對其在細胞內的去磷酸化過程進行跟蹤研究,發(fā)現該蛋白質在細胞內會快速去磷酸化,并且129位磷酸化修飾會加快α-突觸核蛋白質降解。本文的研究...
【文章來源】：中國科學院大學(中國科學院武漢物理與數學研究所)湖北省
【文章頁數】：164 頁
【學位級別】：博士
【部分圖文】：
圖１．１細胞內復雜的環(huán)境１２４１??Ｆｉｇｕｒｅ?１．１?Ｔｈｅ?ｃｏｍｐｌｅｘ?ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ?ｉｎ?ｃｅｌｌ??
細胞中化學修飾蛋白及生物大分子相互作用的核磁共振研究??（Ａ）?Ｐｒｏｔｅｉｎ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?Ｐｒｏｔｅｉｎ?ｄｅｌｉｖｅｒｙ??Ｖ－＾＾＝＝＝＝＝＾??（Ｄ）?Ｍｉｃｒｏｉｒ＾ｅｃｈｏｎ?（￡）?ＣＰＰ?ｄｅｌｉｖｅｒｙ??ＣＥＤ：Ｂ（＾ｄ?＾?＾??和：，＿適??Ｖ?ｙ?（Ｆ）?ｐ〇ｒｅ－＇〇＾ｉｎｇｔｏｘ，ｎｓ?（Ｑ）?Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ??圖１．２不同的Ｉｎ－ｃｅｌｌ?ＮＭＲ方法示意圖１１５１??Ｆｉｇｕｒｅ?１．２?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｏｖｅｒｖｉｅｗ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｉｎ－ｃｅｌｌ?ＮＭＲ?ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ．??將特定蛋白質表達質粒（紅色）轉染進入細菌（Ａ）、酵母（Ｂ）、昆蟲或哺乳動物細胞??系（Ｃ）中，通過質粒過表達方法對目標蛋白質進行標記表達，實現在細胞內富集特定蛋白??質（綠色）。將同位素標記的特定生物大分子（藍色），通過顯微注射（Ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）的方??法富集到非洲爪蟾卵母細胞（Ｄ），通過細胞穿梭肽（Ｃｅｌｌ－ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇｐｅｐｔｉｄｅｓ，ＣＰＰ．Ｅ）、穿孔??毒素（Ｐｏｒｅ－ｆｏｒｍｉｎｇｔｏｘｉｎｓ，Ｆ）、電穿孔（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ，?Ｇ）方法富集到哺乳動物細胞。??１．２．２真核細胞丨ｎ－ｃｅｌｌ?ＮＭＲ??盡管基于原核大腸桿菌的丨ｎ－ｃｅｌｌ?ＮＭＲ得到了很好的發(fā)展，但真核細胞結構??更加復雜，也發(fā)生著更為高級的生化過程，因此真核細胞內的Ｉｎ－ｃｅｌｌ?ＮＭＲ顯得??更為重要。除了原核大腸桿菌可以進行質粒過表達外，真核細胞也可以通過這種??方法來實現丨ｎ－ｃｅｌｌ?ＮＭＲ樣品的制備，且原理和操作方法類似。酵母最
矢量Ｍ，且方向與Ｂ。相同。當激發(fā)線圈發(fā)射的射頻脈沖頻率與原子核拉莫爾頻??率（〇相同時，脈沖會使宏觀磁矢量Ｍ繞著脈沖的方向進行章動，同時繞著Ｂ〇的??方向進動。脈沖停止后，宏觀磁矢量Ｍ會回到Ｂ〇方向，并且釋放能量，產生隨??時間自由感應衰減（Ｆｒｅｅ?ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ?ｄｅｃａｙ，?ＦＩＤ）的電流信號。經過離散傅里葉變??換（Ｆｏｕｒｉｅｒ?ｔｒａｎｓｆｏｒｍ，ＦＴ?），可以將時域ＨＤ信號轉化為頻域ＮＭＲ信號，即ＮＭＲ??譜圖。理想條件下，原子核的拉摩爾頻率ｃｏ就是ＮＭＲ信號的頻率（圖１．３）。??／｛?／Ｃ〇Ｎ??ｆ?Ｉ??＾?Ｉ?＼?ＮＭＲ?Ｓｉｇｎａｌ??ｘ?Ｎｕｃｌｅａｒ?＇?Ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ?ｍａｇｎｅｔｉｚａｔｉｏｎ??圖１．３原子核的磁共振信號檢測??Ｆｉｇｕｒｅ?１．３?Ｔｈｅ?ｄｅｔｅｃｔ?ｏｆ?ｎｕｌｃｅａｒ?ｍａｇｎｅｔｉｃ?ｒｅｓｏｎａｎｃｅ??在外磁場（Ｂ０）中，激發(fā)線圈發(fā)射射頻脈沖對原子核的宏觀磁矢量進行操縱，之后接收??線圈接收原子核釋放能量而產生的自由感應衰減（ＦＩＤ）信號，最后經過離散傅里葉變換（ＦＴ）??轉化為頻域ＮＭＲ信號。??６??
【參考文獻】：
期刊論文
[1]19F NMR技術在蛋白質研究中的應用[J]. 王桂芳,張則婷,徐國華,劉曉黎,吳瓊,白佳,葉炎生,李從剛,劉買利. 波譜學雜志. 2012(04)
博士論文
[1]復雜環(huán)境下蛋白質結構、功能與穩(wěn)定性的NMR研究[D]. 成凱.中國科學院大學(中國科學院武漢物理與數學研究所) 2017
[2]核酸適配體分子識別機制及復雜環(huán)境下G-四鏈體的構象研究[D]. 趙嘉靜.中國科學院大學(中國科學院武漢物理與數學研究所) 2017
[3]細胞內蛋白質的19F核磁共振方法與應用研究[D]. 葉炎生.中國科學院研究生院(武漢物理與數學研究所) 2015
本文編號：3090876
【文章來源】：中國科學院大學(中國科學院武漢物理與數學研究所)湖北省
【文章頁數】：164 頁
【學位級別】：博士
【部分圖文】：
圖１．１細胞內復雜的環(huán)境１２４１??Ｆｉｇｕｒｅ?１．１?Ｔｈｅ?ｃｏｍｐｌｅｘ?ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ?ｉｎ?ｃｅｌｌ??
細胞中化學修飾蛋白及生物大分子相互作用的核磁共振研究??（Ａ）?Ｐｒｏｔｅｉｎ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?Ｐｒｏｔｅｉｎ?ｄｅｌｉｖｅｒｙ??Ｖ－＾＾＝＝＝＝＝＾??（Ｄ）?Ｍｉｃｒｏｉｒ＾ｅｃｈｏｎ?（￡）?ＣＰＰ?ｄｅｌｉｖｅｒｙ??ＣＥＤ：Ｂ（＾ｄ?＾?＾??和：，＿適??Ｖ?ｙ?（Ｆ）?ｐ〇ｒｅ－＇〇＾ｉｎｇｔｏｘ，ｎｓ?（Ｑ）?Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ??圖１．２不同的Ｉｎ－ｃｅｌｌ?ＮＭＲ方法示意圖１１５１??Ｆｉｇｕｒｅ?１．２?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｏｖｅｒｖｉｅｗ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｉｎ－ｃｅｌｌ?ＮＭＲ?ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ．??將特定蛋白質表達質粒（紅色）轉染進入細菌（Ａ）、酵母（Ｂ）、昆蟲或哺乳動物細胞??系（Ｃ）中，通過質粒過表達方法對目標蛋白質進行標記表達，實現在細胞內富集特定蛋白??質（綠色）。將同位素標記的特定生物大分子（藍色），通過顯微注射（Ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）的方??法富集到非洲爪蟾卵母細胞（Ｄ），通過細胞穿梭肽（Ｃｅｌｌ－ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇｐｅｐｔｉｄｅｓ，ＣＰＰ．Ｅ）、穿孔??毒素（Ｐｏｒｅ－ｆｏｒｍｉｎｇｔｏｘｉｎｓ，Ｆ）、電穿孔（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ，?Ｇ）方法富集到哺乳動物細胞。??１．２．２真核細胞丨ｎ－ｃｅｌｌ?ＮＭＲ??盡管基于原核大腸桿菌的丨ｎ－ｃｅｌｌ?ＮＭＲ得到了很好的發(fā)展，但真核細胞結構??更加復雜，也發(fā)生著更為高級的生化過程，因此真核細胞內的Ｉｎ－ｃｅｌｌ?ＮＭＲ顯得??更為重要。除了原核大腸桿菌可以進行質粒過表達外，真核細胞也可以通過這種??方法來實現丨ｎ－ｃｅｌｌ?ＮＭＲ樣品的制備，且原理和操作方法類似。酵母最
矢量Ｍ，且方向與Ｂ。相同。當激發(fā)線圈發(fā)射的射頻脈沖頻率與原子核拉莫爾頻??率（〇相同時，脈沖會使宏觀磁矢量Ｍ繞著脈沖的方向進行章動，同時繞著Ｂ〇的??方向進動。脈沖停止后，宏觀磁矢量Ｍ會回到Ｂ〇方向，并且釋放能量，產生隨??時間自由感應衰減（Ｆｒｅｅ?ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ?ｄｅｃａｙ，?ＦＩＤ）的電流信號。經過離散傅里葉變??換（Ｆｏｕｒｉｅｒ?ｔｒａｎｓｆｏｒｍ，ＦＴ?），可以將時域ＨＤ信號轉化為頻域ＮＭＲ信號，即ＮＭＲ??譜圖。理想條件下，原子核的拉摩爾頻率ｃｏ就是ＮＭＲ信號的頻率（圖１．３）。??／｛?／Ｃ〇Ｎ??ｆ?Ｉ??＾?Ｉ?＼?ＮＭＲ?Ｓｉｇｎａｌ??ｘ?Ｎｕｃｌｅａｒ?＇?Ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ?ｍａｇｎｅｔｉｚａｔｉｏｎ??圖１．３原子核的磁共振信號檢測??Ｆｉｇｕｒｅ?１．３?Ｔｈｅ?ｄｅｔｅｃｔ?ｏｆ?ｎｕｌｃｅａｒ?ｍａｇｎｅｔｉｃ?ｒｅｓｏｎａｎｃｅ??在外磁場（Ｂ０）中，激發(fā)線圈發(fā)射射頻脈沖對原子核的宏觀磁矢量進行操縱，之后接收??線圈接收原子核釋放能量而產生的自由感應衰減（ＦＩＤ）信號，最后經過離散傅里葉變換（ＦＴ）??轉化為頻域ＮＭＲ信號。??６??
【參考文獻】：
期刊論文
[1]19F NMR技術在蛋白質研究中的應用[J]. 王桂芳,張則婷,徐國華,劉曉黎,吳瓊,白佳,葉炎生,李從剛,劉買利. 波譜學雜志. 2012(04)
博士論文
[1]復雜環(huán)境下蛋白質結構、功能與穩(wěn)定性的NMR研究[D]. 成凱.中國科學院大學(中國科學院武漢物理與數學研究所) 2017
[2]核酸適配體分子識別機制及復雜環(huán)境下G-四鏈體的構象研究[D]. 趙嘉靜.中國科學院大學(中國科學院武漢物理與數學研究所) 2017
[3]細胞內蛋白質的19F核磁共振方法與應用研究[D]. 葉炎生.中國科學院研究生院(武漢物理與數學研究所) 2015
本文編號：3090876
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