細(xì)胞是生命的基本單位,也是生物大分子發(fā)揮生物功能的主要場(chǎng)所。細(xì)胞的環(huán)境極其復(fù)雜,它內(nèi)部的體積排阻和化學(xué)弱相互作用時(shí)刻影響著生物大分子的狀態(tài)變化和功能發(fā)揮。細(xì)胞內(nèi)核磁共振（In-cellNMR）可以在活細(xì)胞內(nèi)獲得原子水平分辨的生物大分子結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)信息,幫助人們了解細(xì)胞環(huán)境對(duì)于生物大分子結(jié)構(gòu)和功能的影響。本文主要運(yùn)用In-cell NMR方法,使用19F作為生物大分子的原子探針,對(duì)細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)化學(xué)修飾、蛋白質(zhì)相互作用以及核酸G-四鏈體穩(wěn)定性及相互作用展開(kāi)研究,具體內(nèi)容如下:In-cell NMR方法研究細(xì)胞內(nèi)α-突觸核蛋白的磷酸化修飾及其降解蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)會(huì)發(fā)生廣泛的化學(xué)修飾,磷酸化是其中一種十分常見(jiàn)且重要的修飾類(lèi)型。現(xiàn)階段,在活細(xì)胞內(nèi)對(duì)蛋白質(zhì)磷酸化進(jìn)行直接、實(shí)時(shí)的觀測(cè)仍然存在困難。本文通過(guò)In-cell NMR方法實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)磷酸化的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè),并開(kāi)展磷酸化修飾對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性影響的研究。通過(guò)選用帕金森癥相關(guān)的129位磷酸化α-突觸核蛋白作為研究模型,對(duì)其在細(xì)胞內(nèi)的去磷酸化過(guò)程進(jìn)行跟蹤研究,發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)會(huì)快速去磷酸化,并且129位磷酸化修飾會(huì)加快α-突觸核蛋白質(zhì)降解。本文的研究... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)科學(xué)院大學(xué)(中國(guó)科學(xué)院武漢物理與數(shù)學(xué)研究所)湖北省

【文章頁(yè)數(shù)】：164 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

圖１．１細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的環(huán)境１２４１??Ｆｉｇｕｒｅ?１．１?Ｔｈｅ?ｃｏｍｐｌｅｘ?ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ?ｉｎ?ｃｅｌｌ??

細(xì)胞中化學(xué)修飾蛋白及生物大分子相互作用的核磁共振研究??（Ａ）?Ｐｒｏｔｅｉｎ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?Ｐｒｏｔｅｉｎ?ｄｅｌｉｖｅｒｙ??Ｖ－＾＾＝＝＝＝＝＾??（Ｄ）?Ｍｉｃｒｏｉｒ＾ｅｃｈｏｎ?（￡）?ＣＰＰ?ｄｅｌｉｖｅｒｙ??ＣＥＤ：Ｂ（＾ｄ?＾?＾??和：，＿適??Ｖ?ｙ?（Ｆ）?ｐ〇ｒｅ－＇〇＾ｉｎｇｔｏｘ，ｎｓ?（Ｑ）?Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ??圖１．２不同的Ｉｎ－ｃｅｌｌ?ＮＭＲ方法示意圖１１５１??Ｆｉｇｕｒｅ?１．２?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｏｖｅｒｖｉｅｗ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｉｎ－ｃｅｌｌ?ＮＭＲ?ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ．??將特定蛋白質(zhì)表達(dá)質(zhì)粒（紅色）轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)菌（Ａ）、酵母（Ｂ）、昆蟲(chóng)或哺乳動(dòng)物細(xì)胞??系（Ｃ）中，通過(guò)質(zhì)粒過(guò)表達(dá)方法對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記表達(dá)，實(shí)現(xiàn)在細(xì)胞內(nèi)富集特定蛋白??質(zhì)（綠色）。將同位素標(biāo)記的特定生物大分子（藍(lán)色），通過(guò)顯微注射（Ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）的方??法富集到非洲爪蟾卵母細(xì)胞（Ｄ），通過(guò)細(xì)胞穿梭肽（Ｃｅｌｌ－ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇｐｅｐｔｉｄｅｓ，ＣＰＰ．Ｅ）、穿孔??毒素（Ｐｏｒｅ－ｆｏｒｍｉｎｇｔｏｘｉｎｓ，Ｆ）、電穿孔（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ，?Ｇ）方法富集到哺乳動(dòng)物細(xì)胞。??１．２．２真核細(xì)胞丨ｎ－ｃｅｌｌ?ＮＭＲ??盡管基于原核大腸桿菌的丨ｎ－ｃｅｌｌ?ＮＭＲ得到了很好的發(fā)展，但真核細(xì)胞結(jié)構(gòu)??更加復(fù)雜，也發(fā)生著更為高級(jí)的生化過(guò)程，因此真核細(xì)胞內(nèi)的Ｉｎ－ｃｅｌｌ?ＮＭＲ顯得??更為重要。除了原核大腸桿菌可以進(jìn)行質(zhì)粒過(guò)表達(dá)外，真核細(xì)胞也可以通過(guò)這種??方法來(lái)實(shí)現(xiàn)丨ｎ－ｃｅｌｌ?ＮＭＲ樣品的制備，且原理和操作方法類(lèi)似。酵母最

矢量Ｍ，且方向與Ｂ。相同。當(dāng)激發(fā)線(xiàn)圈發(fā)射的射頻脈沖頻率與原子核拉莫爾頻??率（〇相同時(shí)，脈沖會(huì)使宏觀磁矢量Ｍ繞著脈沖的方向進(jìn)行章動(dòng)，同時(shí)繞著Ｂ〇的??方向進(jìn)動(dòng)。脈沖停止后，宏觀磁矢量Ｍ會(huì)回到Ｂ〇方向，并且釋放能量，產(chǎn)生隨??時(shí)間自由感應(yīng)衰減（Ｆｒｅｅ?ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ?ｄｅｃａｙ，?ＦＩＤ）的電流信號(hào)。經(jīng)過(guò)離散傅里葉變??換（Ｆｏｕｒｉｅｒ?ｔｒａｎｓｆｏｒｍ，ＦＴ?），可以將時(shí)域ＨＤ信號(hào)轉(zhuǎn)化為頻域ＮＭＲ信號(hào)，即ＮＭＲ??譜圖。理想條件下，原子核的拉摩爾頻率ｃｏ就是ＮＭＲ信號(hào)的頻率（圖１．３）。??／｛?／Ｃ〇Ｎ??ｆ?Ｉ??＾?Ｉ?＼?ＮＭＲ?Ｓｉｇｎａｌ??ｘ?Ｎｕｃｌｅａｒ?＇?Ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ?ｍａｇｎｅｔｉｚａｔｉｏｎ??圖１．３原子核的磁共振信號(hào)檢測(cè)??Ｆｉｇｕｒｅ?１．３?Ｔｈｅ?ｄｅｔｅｃｔ?ｏｆ?ｎｕｌｃｅａｒ?ｍａｇｎｅｔｉｃ?ｒｅｓｏｎａｎｃｅ??在外磁場(chǎng)（Ｂ０）中，激發(fā)線(xiàn)圈發(fā)射射頻脈沖對(duì)原子核的宏觀磁矢量進(jìn)行操縱，之后接收??線(xiàn)圈接收原子核釋放能量而產(chǎn)生的自由感應(yīng)衰減（ＦＩＤ）信號(hào)，最后經(jīng)過(guò)離散傅里葉變換（ＦＴ）??轉(zhuǎn)化為頻域ＮＭＲ信號(hào)。??６??

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]19F NMR技術(shù)在蛋白質(zhì)研究中的應(yīng)用[J]. 王桂芳,張則婷,徐國(guó)華,劉曉黎,吳瓊,白佳,葉炎生,李從剛,劉買(mǎi)利.  波譜學(xué)雜志. 2012(04)

博士論文
[1]復(fù)雜環(huán)境下蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能與穩(wěn)定性的NMR研究[D]. 成凱.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)(中國(guó)科學(xué)院武漢物理與數(shù)學(xué)研究所) 2017
[2]核酸適配體分子識(shí)別機(jī)制及復(fù)雜環(huán)境下G-四鏈體的構(gòu)象研究[D]. 趙嘉靜.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)(中國(guó)科學(xué)院武漢物理與數(shù)學(xué)研究所) 2017
[3]細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的19F核磁共振方法與應(yīng)用研究[D]. 葉炎生.中國(guó)科學(xué)院研究生院(武漢物理與數(shù)學(xué)研究所) 2015



本文編號(hào)：3090876