基于DNA循環(huán)放大通用型熒光生物傳感器的研究
發(fā)布時間：2021-02-18 18:53
建立快速、高靈敏度和高選擇性的通用型生物傳感器是生化分析工作者的重要任務。通用型生物傳感器是指使用相同的工作原理,通過改變個別測定單元以達到檢測不同物質的目的,其突出優(yōu)點是適用的普遍性。高靈敏度的檢測方法很多是基于多重循環(huán)的DNA信號放大。DNAzyme是一種具有催化功能的DNA片段,由結合位點和識別催化位點組成,可以與底物雜交并裂解底物。與傳統(tǒng)的蛋白質酶相比,DNAzyme具有多功能性設計、在室溫和高溫穩(wěn)定、低成本、易于合成和標記的特點。G-三鏈體結構被認為是G-四鏈體結構折疊過程最合理的中間體之一,這種結構在體外也顯示出類似于G-四鏈體的催化功能。由于G-三鏈體具有更少的G堿基個數(shù),在設計富G發(fā)夾時頸部的G-C更少,設計更為靈活。很多核酸染料與G-三鏈體作用所產生的熒光信號,可根據(jù)熒光信號強度的不同來定量檢測目標物。本論文主要是以G-三鏈體作為熒光信號探針,利用DNAzyme的催化剪切和核酸切割酶輔助目標物循環(huán)并依據(jù)核酸染料的光譜特性,構建不同的通用型熒光生物傳感器,分別對DNA、金屬離子和蛋白質進行檢測:（1）基于Exo III輔助循環(huán)和DNAzyme擴增超靈敏的熒光檢測H5N1...
【文章來源】：湘潭大學湖南省
【文章頁數(shù)】：76 頁
【學位級別】：碩士
【部分圖文】：
基于氧化石墨烯和ssDNA吸附作用的通用型生物傳感器原理圖
第1章緒論3圖1-2基于Ru絡合物對量子點熒光猝滅的通用型生物傳感器原理圖1.2G-三鏈體1.2.1G-三鏈體的介紹G-四鏈體是一種特殊的DNA二級結構，在1962年被第一次發(fā)現(xiàn)[12]。三維立體結構的G-四鏈體是通過Hoogsteen氫鍵相互作用連接成平面螺旋的四分體結構，當其以非共價結合時小分子配體形成無標記探針，故而有催化和點亮熒光的功能。由于它們的生物學意義和固有優(yōu)勢，所以基于G-四鏈體的無標記探針已廣泛應用于生物過程檢測[13]。然而，在應用于生化檢測和分析時，G-四鏈體在控制和釋放其結構存在一些問題[14]。例如，G-四鏈體與富含C的序列結合太緊密而使其難與目標物脫鉤[14]。因此，用較短的富G序列可能更適合生物傳感器的制造。最近，G-三鏈體被確認是一種新型的DNA結構，是由3個G片段組成的富G序列，類似于G-四鏈體，但是核酸個數(shù)要少于G-四鏈體，由于其生物功能潛力和特殊的結構受到人們的廣泛關注[15]。公認的G-三鏈體結構被普遍是G-四鏈體結構折疊過程最合理的中間體之一[13,14,16]。同時，這種結構在體外也顯示出類似于G-四鏈體的催化功能[13]。通過核磁共振和元二色譜以及示差掃描量熱法得出G-三鏈體是以Hoogsteen氫鍵連接的。此外，溶液狀態(tài)下的G-三鏈體可被原子力顯微鏡觀察到[14,16]。這種新型的G-三鏈體可用于設計新型的熒光分子信標。由于G-三鏈體具有更少的G堿基個數(shù)，在設計富G發(fā)夾時頸部的G-C更少些，是設計更為靈活[13]。除此之外，G-三鏈體同G-四鏈體一樣可被ThT誘導折疊，
第1章緒論4并增強其熒光強度[17-19]。1.2.2G-三鏈體的應用G-三鏈體作為標記物具有成本低、易獲得和穩(wěn)定性好的特點，而且以核酸作為標記物，減少了非特異性吸附，使傳感器靈敏度增加；此外，在探針設計上也更為靈活，核酸序列可調控，可以設計包含目標物識別區(qū)域和其他功能區(qū)域。Rong-MeiKong等人[20]建立了一個基于G-三鏈體的功能分子信標無標記的熒光傳感系統(tǒng)，該系統(tǒng)的發(fā)夾結構穩(wěn)定由Hg2+介導。實驗原理圖如1-3所示，在存在Hg2+的情況下，由于“T-Hg2+-T”的強相互作用，含有“T”堿基的擴展G-三鏈體序列可以形成穩(wěn)定的發(fā)夾結構，從而導致富G序列鎖定在莖中。但是，當加入目標物谷胱甘肽（GSH），通過更強的“GSH-Hg2+”相互作用便可以打開發(fā)夾結構，使富G序列處于游離狀態(tài)，因此，在加入熒光染料硫黃素T（ThT）時，便可與G-三鏈體結合產生強的熒光信號，從而達到檢測的目的。這項工作可能會擴展G-三鏈體作為功能性分子信標對小生物分子檢測無標記熒光探針的新視野。圖1-3基于G-三鏈體和ThT的無標記熒光傳感器的原理圖RuiyingLi等人[21]將G-三鏈體與等溫指數(shù)擴增反應（EXPAR）結合在一起，以實現(xiàn)簡單而靈敏的生物傳感策略。實驗原理圖如1-4所示，HIV-DNA作為目標物，EXPAR過程是通過HIV-DNA與G3模板A"區(qū)的雜交而觸發(fā)的。在加入聚合酶和dNTP的情況下，部分雙鏈體沿模板延伸以產生完整的dsDNA。在Nt.BstNBI和DNA聚合酶的剪切和聚合作用下，從而釋放短的DNA鏈（BX）和G-三鏈體（B）。同時，切口反應引發(fā)新的延伸、切割和釋放（表示為循環(huán)I）。
【參考文獻】：
期刊論文
[1]基于λ核酸外切酶輔助放大的化學發(fā)光傳感器用于DNA的靈敏檢測[J]. 陳佳,郭蕓蕓,陳橋,邱洪燈. 分析化學. 2015(10)
[2]基于核酸切割酶與脫氧核酶的熒光循環(huán)放大系統(tǒng)檢測鉛（Ⅱ）[J]. 趙永席,齊林,楊衛(wèi)軍,魏帥,王亞玲. 分析化學. 2012(08)
碩士論文
[1]基于生物信號放大技術的核酸適配體傳感新方法研究[D]. 陳志超.湖北師范大學 2019
[2]熒光及共振瑞利散射光譜法檢測環(huán)境中痕量手性污染物[D]. 黃云梅.重慶三峽學院 2019
[3]高信背比DNA酶-SYBR Green I化學發(fā)光傳感體系的研究[D]. 張后春.成都理工大學 2018
[4]基于物聯(lián)網平臺的紫外可見分光光度計自動測量系統(tǒng)研究[D]. 晏健榮.東華大學 2017
[5]基于滾環(huán)擴增和核酸外切酶Ⅲ輔助循環(huán)放大的高靈敏熒光生物傳感器研究[D]. 劉陳力為.湖南大學 2016
[6]基于熒光光譜法的農用車尾氣成分檢測的研究[D]. 林大星.安徽農業(yè)大學 2013
本文編號：3039955
【文章來源】：湘潭大學湖南省
【文章頁數(shù)】：76 頁
【學位級別】：碩士
【部分圖文】：
基于氧化石墨烯和ssDNA吸附作用的通用型生物傳感器原理圖
第1章緒論3圖1-2基于Ru絡合物對量子點熒光猝滅的通用型生物傳感器原理圖1.2G-三鏈體1.2.1G-三鏈體的介紹G-四鏈體是一種特殊的DNA二級結構，在1962年被第一次發(fā)現(xiàn)[12]。三維立體結構的G-四鏈體是通過Hoogsteen氫鍵相互作用連接成平面螺旋的四分體結構，當其以非共價結合時小分子配體形成無標記探針，故而有催化和點亮熒光的功能。由于它們的生物學意義和固有優(yōu)勢，所以基于G-四鏈體的無標記探針已廣泛應用于生物過程檢測[13]。然而，在應用于生化檢測和分析時，G-四鏈體在控制和釋放其結構存在一些問題[14]。例如，G-四鏈體與富含C的序列結合太緊密而使其難與目標物脫鉤[14]。因此，用較短的富G序列可能更適合生物傳感器的制造。最近，G-三鏈體被確認是一種新型的DNA結構，是由3個G片段組成的富G序列，類似于G-四鏈體，但是核酸個數(shù)要少于G-四鏈體，由于其生物功能潛力和特殊的結構受到人們的廣泛關注[15]。公認的G-三鏈體結構被普遍是G-四鏈體結構折疊過程最合理的中間體之一[13,14,16]。同時，這種結構在體外也顯示出類似于G-四鏈體的催化功能[13]。通過核磁共振和元二色譜以及示差掃描量熱法得出G-三鏈體是以Hoogsteen氫鍵連接的。此外，溶液狀態(tài)下的G-三鏈體可被原子力顯微鏡觀察到[14,16]。這種新型的G-三鏈體可用于設計新型的熒光分子信標。由于G-三鏈體具有更少的G堿基個數(shù)，在設計富G發(fā)夾時頸部的G-C更少些，是設計更為靈活[13]。除此之外，G-三鏈體同G-四鏈體一樣可被ThT誘導折疊，
第1章緒論4并增強其熒光強度[17-19]。1.2.2G-三鏈體的應用G-三鏈體作為標記物具有成本低、易獲得和穩(wěn)定性好的特點，而且以核酸作為標記物，減少了非特異性吸附，使傳感器靈敏度增加；此外，在探針設計上也更為靈活，核酸序列可調控，可以設計包含目標物識別區(qū)域和其他功能區(qū)域。Rong-MeiKong等人[20]建立了一個基于G-三鏈體的功能分子信標無標記的熒光傳感系統(tǒng)，該系統(tǒng)的發(fā)夾結構穩(wěn)定由Hg2+介導。實驗原理圖如1-3所示，在存在Hg2+的情況下，由于“T-Hg2+-T”的強相互作用，含有“T”堿基的擴展G-三鏈體序列可以形成穩(wěn)定的發(fā)夾結構，從而導致富G序列鎖定在莖中。但是，當加入目標物谷胱甘肽（GSH），通過更強的“GSH-Hg2+”相互作用便可以打開發(fā)夾結構，使富G序列處于游離狀態(tài)，因此，在加入熒光染料硫黃素T（ThT）時，便可與G-三鏈體結合產生強的熒光信號，從而達到檢測的目的。這項工作可能會擴展G-三鏈體作為功能性分子信標對小生物分子檢測無標記熒光探針的新視野。圖1-3基于G-三鏈體和ThT的無標記熒光傳感器的原理圖RuiyingLi等人[21]將G-三鏈體與等溫指數(shù)擴增反應（EXPAR）結合在一起，以實現(xiàn)簡單而靈敏的生物傳感策略。實驗原理圖如1-4所示，HIV-DNA作為目標物，EXPAR過程是通過HIV-DNA與G3模板A"區(qū)的雜交而觸發(fā)的。在加入聚合酶和dNTP的情況下，部分雙鏈體沿模板延伸以產生完整的dsDNA。在Nt.BstNBI和DNA聚合酶的剪切和聚合作用下，從而釋放短的DNA鏈（BX）和G-三鏈體（B）。同時，切口反應引發(fā)新的延伸、切割和釋放（表示為循環(huán)I）。
【參考文獻】：
期刊論文
[1]基于λ核酸外切酶輔助放大的化學發(fā)光傳感器用于DNA的靈敏檢測[J]. 陳佳,郭蕓蕓,陳橋,邱洪燈. 分析化學. 2015(10)
[2]基于核酸切割酶與脫氧核酶的熒光循環(huán)放大系統(tǒng)檢測鉛（Ⅱ）[J]. 趙永席,齊林,楊衛(wèi)軍,魏帥,王亞玲. 分析化學. 2012(08)
碩士論文
[1]基于生物信號放大技術的核酸適配體傳感新方法研究[D]. 陳志超.湖北師范大學 2019
[2]熒光及共振瑞利散射光譜法檢測環(huán)境中痕量手性污染物[D]. 黃云梅.重慶三峽學院 2019
[3]高信背比DNA酶-SYBR Green I化學發(fā)光傳感體系的研究[D]. 張后春.成都理工大學 2018
[4]基于物聯(lián)網平臺的紫外可見分光光度計自動測量系統(tǒng)研究[D]. 晏健榮.東華大學 2017
[5]基于滾環(huán)擴增和核酸外切酶Ⅲ輔助循環(huán)放大的高靈敏熒光生物傳感器研究[D]. 劉陳力為.湖南大學 2016
[6]基于熒光光譜法的農用車尾氣成分檢測的研究[D]. 林大星.安徽農業(yè)大學 2013
本文編號：3039955
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