核酸熒光探針因具有親和性強(qiáng)、特異性好、易于合成設(shè)計(jì)等優(yōu)勢(shì)而廣泛應(yīng)用于各種目標(biāo)物的檢測(cè)。在本博士學(xué)位論文的研究工作中,針對(duì)已有的核酸熒光探針大多需要標(biāo)記、探針制備成本高且親和力差,以及多功能探針?lè)N類(lèi)相對(duì)較少、且合成條件復(fù)雜、生物毒性較高等問(wèn)題,設(shè)計(jì)了兩種免標(biāo)記型的核酸熒光探針和一種可生物降解的多功能納米探針,并分別考察了其在生化分析中的應(yīng)用性能,具體工作如下:1.設(shè)計(jì)了一種免標(biāo)記型的熒光核酸探針,結(jié)合核酸外切酶Exo Ⅲ和二級(jí)靶標(biāo)的信號(hào)放大,實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)核酸的低成本、高靈敏檢測(cè)。探針為發(fā)夾結(jié)構(gòu),3'端含有10個(gè)突出堿基可以抵御酶的降解,莖部?jī)?nèi)藏一段與靶標(biāo)DNA相同的二級(jí)靶標(biāo)序列和一組C:C錯(cuò)配,前者可輔助信號(hào)放大,后者可嵌入熒光團(tuán)ATMND并淬滅其熒光。當(dāng)探針識(shí)別目標(biāo)核酸后,發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開(kāi)可誘發(fā)Exo Ⅲ從3'端降解核酸探針。探針的降解釋放出靶標(biāo)DNA、二級(jí)靶標(biāo)序列和ATMND,并恢復(fù)ATMND的熒光。靶標(biāo)核酸和二級(jí)靶標(biāo)序列繼續(xù)參與下一輪的循環(huán),實(shí)現(xiàn)熒光信號(hào)的指數(shù)放大。該免標(biāo)記型熒光探針可在室溫、經(jīng)一步操作即實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)DNA的高靈敏檢測(cè),最低檢測(cè)限為6pM。此外,核酸熒光探針還具有較好的選擇性,可區(qū)分單堿基錯(cuò)配,并在血清等實(shí)際樣品時(shí)表現(xiàn)出了良好的精密度。2.設(shè)計(jì)了一種比率型的免標(biāo)記熒光核酸適配體探針,實(shí)現(xiàn)了血清、尿液和唾液等多種復(fù)雜體系中可卡因的高靈敏快速檢測(cè)。可卡因適配體GC-38的Y型疏水空腔和莖部雙鏈區(qū)域可分別嵌入熒光團(tuán)ATMND和SYBRGreenⅠ(SGI)。其中,ATMND作為熒光信號(hào)輸出基團(tuán),可被可卡因選擇性置換而恢復(fù)熒光;而SGI作為內(nèi)標(biāo)基團(tuán),其熒光不受可卡因的干擾,在測(cè)定過(guò)程中始終保持恒定。基于ATMND和SGI熒光信號(hào)比值的變化,該免標(biāo)記型探針對(duì)可卡因展現(xiàn)出了良好的分析性能。在最優(yōu)條件下,該探針的線(xiàn)性范圍為0.1～10 μM,最低檢測(cè)限為56 nM,響應(yīng)時(shí)間僅需20 s,并可在尿液、唾液和血清等復(fù)雜體系中實(shí)現(xiàn)可卡因的檢測(cè)。3.設(shè)計(jì)了一種對(duì)A549癌細(xì)胞具有靶向識(shí)別、熒光成像和光熱治療-化學(xué)治療聯(lián)合治療作用的聚多巴胺/核酸適配體凝膠多功能納米探針。探針為核殼結(jié)構(gòu),聚多巴胺納米球內(nèi)核具有光熱性質(zhì),核酸適配體凝膠外殼既可負(fù)載藥物分子,又可識(shí)別癌細(xì)胞并對(duì)其熒光成像。該多功能探針進(jìn)入癌細(xì)胞內(nèi)部后,在近紅外光照射下,一方面可產(chǎn)生光熱效應(yīng)使細(xì)胞局域溫度升高,有效殺滅癌細(xì)胞;另一方面可促使DNA凝膠解鏈釋放出內(nèi)嵌的抗癌藥物Dox,實(shí)現(xiàn)對(duì)癌細(xì)胞的藥物治療。該多功能探針對(duì)A549細(xì)胞具有較強(qiáng)的靶向識(shí)別和熒光成像能力、良好的穩(wěn)定性、較低的細(xì)胞毒性,較高的光熱轉(zhuǎn)換效率(38%)和載藥量(50%),在光熱治療和化學(xué)治療的聯(lián)合作用下可將癌細(xì)胞的存活率降至48%。納米探針集成了對(duì)癌細(xì)胞的選擇性識(shí)別、熒光成像、熱療和化療等多種功能,在癌細(xì)胞靶向識(shí)別和治療方面具有較好的應(yīng)用潛力。
【學(xué)位單位】：大連理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：O657.3
【部分圖文】：

ｇｅｐｏｒｒ??Ｌａｂｅｌｅｄ?ＭＢ?｜??Ｌａｂｅｌ－ｆｒｅｅ?ＭＢ??圖Ｕ分子信標(biāo)的結(jié)構(gòu)示意圖％。??Ｆｉｇｕｒｅ?１．１?Ｓｃｈｅｍｅ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｍｏｌｅｃｕｌａｒ?ｂｅａｃｏｎ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ［１８］．??１９９６年Ｔｙａｇｉ和Ｋｒａｍｅｒ首次使用分子信標(biāo)進(jìn)行定量分析Ｗ。相對(duì)于傳統(tǒng)的核針，分子信標(biāo)不僅靈敏度高、特異性強(qiáng)，而且操作簡(jiǎn)便、適用于活體分析，因此在傳感、生物成像和癌癥治療中都充當(dāng)著重要的角色ｔ３１＿３４］。分子信標(biāo)的工作原理如圖所示，在沒(méi)有靶標(biāo)序列存在時(shí)，自由狀態(tài)的分子信標(biāo)呈莖環(huán)狀，莖部的熒光基團(tuán)和基團(tuán)間的距離小于１０?ｎｍ�；跓晒夤舱衲芰哭D(zhuǎn)移（ＦＲＥＴ）原理，熒光團(tuán)發(fā)出的熒淬滅基團(tuán)吸收，并以熱的形式散發(fā)出去使熒光淬滅。當(dāng)目標(biāo)ＤＮＡ出現(xiàn)時(shí)，分子信目標(biāo)ＤＮＡ進(jìn)行互補(bǔ)雜交形成雙鏈結(jié)構(gòu)，莖環(huán)結(jié)構(gòu)被打開(kāi)，熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)距大，無(wú)法發(fā)生共振能量轉(zhuǎn)移，熒光信號(hào)恢復(fù)。熒光的強(qiáng)度與溶液中靶標(biāo)的量成正比關(guān)根據(jù)熒光信號(hào)的強(qiáng)度可以實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)的精準(zhǔn)定量分析。根據(jù)熱力學(xué)平衡關(guān)系，分子信靶標(biāo)ＤＮＡ的雜交特異性要明顯優(yōu)于常規(guī)的線(xiàn)性探針，因此通常具有較好的選擇性。??

１９９６年Ｔｙａｇｉ和Ｋｒａｍｅｒ首次使用分子信標(biāo)進(jìn)行定量分析Ｗ。相對(duì)于傳統(tǒng)的核酸探??針，分子信標(biāo)不僅靈敏度高、特異性強(qiáng)，而且操作簡(jiǎn)便、適用于活體分析，因此在生物??傳感、生物成像和癌癥治療中都充當(dāng)著重要的角色ｔ３１＿３４］。分子信標(biāo)的工作原理如圖１．２??所示，在沒(méi)有靶標(biāo)序列存在時(shí)，自由狀態(tài)的分子信標(biāo)呈莖環(huán)狀，莖部的熒光基團(tuán)和淬滅??基團(tuán)間的距離小于１０?ｎｍ�；跓晒夤舱衲芰哭D(zhuǎn)移（ＦＲＥＴ）原理，熒光團(tuán)發(fā)出的熒光被??淬滅基團(tuán)吸收，并以熱的形式散發(fā)出去使熒光淬滅。當(dāng)目標(biāo)ＤＮＡ出現(xiàn)時(shí)，分子信標(biāo)與??目標(biāo)ＤＮＡ進(jìn)行互補(bǔ)雜交形成雙鏈結(jié)構(gòu)，莖環(huán)結(jié)構(gòu)被打開(kāi)，熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)距離增??大，無(wú)法發(fā)生共振能量轉(zhuǎn)移，熒光信號(hào)恢復(fù)。熒光的強(qiáng)度與溶液中靶標(biāo)的量成正比關(guān)系，??根據(jù)熒光信號(hào)的強(qiáng)度可以實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)的精準(zhǔn)定量分析。根據(jù)熱力學(xué)平衡關(guān)系，分子信標(biāo)與??靶標(biāo)ＤＮＡ的雜交特異性要明顯優(yōu)于常規(guī)的線(xiàn)性探針，因此通常具有較好的選擇性。??ｊ?Ｔａｒｇｅｔ??Ｆ?Ｑ??圖１．２分子

定性好、催化反應(yīng)速率快等優(yōu)勢(shì)。脫氧核酶的催化功能包括ＲＮＡ切割活性、ＤＮＡ切割??活性、卟啉金屬化酶和過(guò)氧化物酶活性、ＤＮＡ激酶活性等。其中，應(yīng)用最廣泛的一類(lèi)??脫氧核酶具有ＲＮＡ切割活性。如圖１．３Ａ所示，這類(lèi)脫氧核酶通常由底物鏈和酶鏈組成，??底物鏈中包含ＲＮＡ切割位點(diǎn)（ｒＡ），而酶鏈由催化環(huán)部和臂構(gòu)成。輔助因子可激活脫??氧核酶，使其可以特異性地將底物鏈中的ＲＮＡ堿基水解切斷。參與脫氧核酶催化過(guò)程??的輔助因子包括金屬離子、中性分子和細(xì)菌等。金屬離子是一類(lèi)比較常見(jiàn)的輔助因子，??在核酸酶工作時(shí)可以起到促進(jìn)脫氧核酶序列正確折疊以形成催化中心、保持酶的活性狀??態(tài)、穩(wěn)定核酸酶的中間過(guò)渡態(tài)、以及屏蔽磷酸骨架所帶負(fù)電荷等作用。不同結(jié)構(gòu)的脫氧??核酶依賴(lài)的金屬離子的種類(lèi)和程度都不同，說(shuō)明脫氧核酶存在一個(gè)或幾個(gè)對(duì)構(gòu)象有嚴(yán)格??要求的金屬離子結(jié)合位點(diǎn)。基于核酸酶活性依賴(lài)于特定金屬離子的特性，多種核酸酶探??針陸續(xù)被開(kāi)發(fā)并用于金屬離子的高靈敏檢測(cè)［３７＠。另一類(lèi)常見(jiàn)的脫氧核酶是Ｇ－四聯(lián)體??ＤＮＡｚｙｍｅ，這類(lèi)酶由一段或幾段富Ｇ堿基的序列構(gòu)成，能在Ｋ＋，?Ｐｂ２＋或ＮＨ４＋的輔助下??折疊形成平行或反平行的四聯(lián)體構(gòu)型，并與氯化高鐵血紅素（ｈｅｍｉｎ）結(jié)合，表現(xiàn)出類(lèi)??過(guò)氧化物酶的活性
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本文編號(hào)：2882390