還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)及其氧化形式(NAD~+)在所有生命系統(tǒng)中都是普遍存在的,并且是超過300種氧化還原酶反應(yīng)所必需的輔酶。在糖酵解、三羧酸循環(huán)及線粒體呼吸等能量代謝途徑中參與了多數(shù)的氧化還原反應(yīng),在能量代謝和呼吸鏈電子傳遞過程中有著重要的作用。傳統(tǒng)的檢測方法是基于細(xì)胞內(nèi)NADH的自發(fā)熒光進(jìn)行檢測及成像,這種方法靈敏度低,容易造成紫外照射損傷及無法避免細(xì)胞內(nèi)其他物質(zhì)的干擾。隨后發(fā)展出電化學(xué)分析法、酶循環(huán)法、高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法等方法。雖然這些方法能對NADH進(jìn)行檢測,但是這些檢測方法只適用于體外NADH的檢測,很難用于細(xì)胞及活體內(nèi)NADH的含量及水平變化的分析�；诖�,我們設(shè)計(jì)合成了兩種可應(yīng)用于細(xì)胞及活體內(nèi),高靈敏度、特異性檢測NADH的熒光探針。該探針對研究NADH相關(guān)的生理、病理過程具有重要的意義。本論文綜述了NADH的理化性質(zhì)、生理功能以及常用的檢測方法,并綜述了基于熒光探針(基因編碼探針、納米探針、小分子探針)檢測NADH的研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢。論文主要包括以下工作:1、我們利用二氰基異氟爾酮作為發(fā)色團(tuán),喹啉鎓作為NADH還原位點(diǎn)設(shè)計(jì)并合成了一種檢測NADH的近紅外(NIR)熒光探針DCI-MQ。探針與NADH反應(yīng)之后,由于存在較強(qiáng)分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(ICT),最大吸收波長紅移至568 nm,并且在660 nm處發(fā)射較強(qiáng)的熒光。在模擬生理?xiàng)l件下(10 mM PBS,pH=7.4),我們測定了該探針對NADH的響應(yīng),在NADH濃度為0~1μM時,探針熒光強(qiáng)度的變化與NADH濃度之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系:F=22.12+134.27[NADH],線性相關(guān)系數(shù)為0.9915,檢測限為12 nM。此外,我們利用該探針成功實(shí)現(xiàn)了對HepG2肝癌細(xì)胞與荷瘤小鼠內(nèi)NADH的檢測及成像。2、為了進(jìn)一步優(yōu)化探針,提高檢測的靈敏度、選擇性,我們利用三氰基呋喃(TCF)合成了另外一種檢測NADH的熒光探針TCF-MQ。探針與NADH反應(yīng)后,發(fā)射波長紅移至610 nm,并且熒光增強(qiáng)。在模擬生理?xiàng)l件下(10 mM PBS,pH=7.4),我們測定了該探針對NADH的響應(yīng),在NADH濃度為0~3μM時,探針熒光強(qiáng)度的變化與NADH濃度之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系:F=83.22+238.42[NADH],線性相關(guān)系數(shù)為0.9819,檢測限為6nM,提高了檢測的靈敏度。
【學(xué)位單位】：山東師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：O657.3
【部分圖文】：

圖 1-1 NAD+與 NADH 的結(jié)構(gòu)式 1-2 所示，NAD+與 NADH 在 259nm 處均有最大吸收，但 NAD第二個吸收峰（吸光系數(shù)為 6.2 103M-1cm-1）。因此，NAD+通 NADH 時，340nm 處吸光度會變化，這也為測量許多酶的活外，NADH 在 340 nm 紫外光激發(fā)下，在 460 nm 處有最大發(fā)ADH 是有熒光的，而 NAD+沒有熒光。根據(jù)這一性質(zhì)，可以發(fā)熒光信號的變化來間接地反映細(xì)胞內(nèi)代謝水平的變化。

圖 1-1 NAD+與 NADH 的結(jié)構(gòu)式 1-2 所示，NAD+與 NADH 在 259nm 處均有最大吸收，但 NAD第二個吸收峰（吸光系數(shù)為 6.2 103M-1cm-1）。因此，NAD+通 NADH 時，340nm 處吸光度會變化，這也為測量許多酶的活外，NADH 在 340 nm 紫外光激發(fā)下，在 460 nm 處有最大發(fā)ADH 是有熒光的，而 NAD+沒有熒光。根據(jù)這一性質(zhì)，可以發(fā)熒光信號的變化來間接地反映細(xì)胞內(nèi)代謝水平的變化。

山東師范大學(xué)碩士學(xué)位論文頭合成途徑中，色氨酸或天冬氨酸在一系列酶的作用下，轉(zhuǎn)換NaMN）[47]。NaMN 在煙酰胺單核苷酸腺苷�；D(zhuǎn)移酶（Nmn煙酸腺嘌呤二核苷酸（NaAD），NaAD 的煙酸部分在 NAD 谷syn1）作用下轉(zhuǎn)化為 NAD+[48]。救途徑中，煙酰胺或煙酸在磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的作用下分別生成NMN）或煙酸單核苷酸（NaMN）。在煙酰胺單核苷酸腺苷酰ATs）的作用下，NMN 轉(zhuǎn)化為 NAD+，NaMN 轉(zhuǎn)化為 NaAD，酰胺合成酶（Nadsyn1）作用下轉(zhuǎn)化為 NAD+[48]。
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本文編號：2878272