還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)及其氧化形式(NAD~+)在所有生命系統(tǒng)中都是普遍存在的,并且是超過300種氧化還原酶反應所必需的輔酶。在糖酵解、三羧酸循環(huán)及線粒體呼吸等能量代謝途徑中參與了多數(shù)的氧化還原反應,在能量代謝和呼吸鏈電子傳遞過程中有著重要的作用。傳統(tǒng)的檢測方法是基于細胞內NADH的自發(fā)熒光進行檢測及成像,這種方法靈敏度低,容易造成紫外照射損傷及無法避免細胞內其他物質的干擾。隨后發(fā)展出電化學分析法、酶循環(huán)法、高效液相色譜法、毛細管電泳法等方法。雖然這些方法能對NADH進行檢測,但是這些檢測方法只適用于體外NADH的檢測,很難用于細胞及活體內NADH的含量及水平變化的分析�；诖�,我們設計合成了兩種可應用于細胞及活體內,高靈敏度、特異性檢測NADH的熒光探針。該探針對研究NADH相關的生理、病理過程具有重要的意義。本論文綜述了NADH的理化性質、生理功能以及常用的檢測方法,并綜述了基于熒光探針(基因編碼探針、納米探針、小分子探針)檢測NADH的研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢。論文主要包括以下工作:1、我們利用二氰基異氟爾酮作為發(fā)色團,喹啉鎓作為NADH還原位點設計并合成了一種檢測NADH的近紅外(NIR)熒光探針DCI-MQ。探針與NADH反應之后,由于存在較強分子內電荷轉移(ICT),最大吸收波長紅移至568 nm,并且在660 nm處發(fā)射較強的熒光。在模擬生理條件下(10 mM PBS,pH=7.4),我們測定了該探針對NADH的響應,在NADH濃度為0~1μM時,探針熒光強度的變化與NADH濃度之間呈現(xiàn)良好的線性關系:F=22.12+134.27[NADH],線性相關系數(shù)為0.9915,檢測限為12 nM。此外,我們利用該探針成功實現(xiàn)了對HepG2肝癌細胞與荷瘤小鼠內NADH的檢測及成像。2、為了進一步優(yōu)化探針,提高檢測的靈敏度、選擇性,我們利用三氰基呋喃(TCF)合成了另外一種檢測NADH的熒光探針TCF-MQ。探針與NADH反應后,發(fā)射波長紅移至610 nm,并且熒光增強。在模擬生理條件下(10 mM PBS,pH=7.4),我們測定了該探針對NADH的響應,在NADH濃度為0~3μM時,探針熒光強度的變化與NADH濃度之間呈現(xiàn)良好的線性關系:F=83.22+238.42[NADH],線性相關系數(shù)為0.9819,檢測限為6nM,提高了檢測的靈敏度。
【學位單位】：山東師范大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：O657.3
【部分圖文】：

圖 1-1 NAD+與 NADH 的結構式 1-2 所示，NAD+與 NADH 在 259nm 處均有最大吸收，但 NAD第二個吸收峰（吸光系數(shù)為 6.2 103M-1cm-1）。因此，NAD+通 NADH 時，340nm 處吸光度會變化，這也為測量許多酶的活外，NADH 在 340 nm 紫外光激發(fā)下，在 460 nm 處有最大發(fā)ADH 是有熒光的，而 NAD+沒有熒光。根據(jù)這一性質，可以發(fā)熒光信號的變化來間接地反映細胞內代謝水平的變化。

圖 1-1 NAD+與 NADH 的結構式 1-2 所示，NAD+與 NADH 在 259nm 處均有最大吸收，但 NAD第二個吸收峰（吸光系數(shù)為 6.2 103M-1cm-1）。因此，NAD+通 NADH 時，340nm 處吸光度會變化，這也為測量許多酶的活外，NADH 在 340 nm 紫外光激發(fā)下，在 460 nm 處有最大發(fā)ADH 是有熒光的，而 NAD+沒有熒光。根據(jù)這一性質，可以發(fā)熒光信號的變化來間接地反映細胞內代謝水平的變化。

山東師范大學碩士學位論文頭合成途徑中，色氨酸或天冬氨酸在一系列酶的作用下，轉換NaMN）[47]。NaMN 在煙酰胺單核苷酸腺苷酰基轉移酶（Nmn煙酸腺嘌呤二核苷酸（NaAD），NaAD 的煙酸部分在 NAD 谷syn1）作用下轉化為 NAD+[48]。救途徑中，煙酰胺或煙酸在磷酸核糖轉移酶的作用下分別生成NMN）或煙酸單核苷酸（NaMN）。在煙酰胺單核苷酸腺苷酰ATs）的作用下，NMN 轉化為 NAD+，NaMN 轉化為 NaAD，酰胺合成酶（Nadsyn1）作用下轉化為 NAD+[48]。
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