將可再生的木質(zhì)纖維素通過生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)液體燃料和化學(xué)品,是解決當(dāng)前石油煤炭等化石資源短缺、能源匱乏問題的有效途徑之一。其中,利用纖維素酶將木質(zhì)纖維素水解成可發(fā)酵的單糖是木質(zhì)纖維素生物轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵步驟。天然木質(zhì)纖維素原料具有結(jié)構(gòu)致密、化學(xué)組成復(fù)雜多樣等特點(diǎn),賦予了木質(zhì)纖維素天然的“生物質(zhì)抗降解屏障(Biomass recalcitrance)”,其中木質(zhì)素的存在是影響木質(zhì)纖維素酶解效率的主要原因之一。木質(zhì)素對纖維素酶的“非生產(chǎn)性”吸附,對酶解效率有明顯的阻礙作用。預(yù)處理是破除木質(zhì)纖維素原料抗降解屏障,提高纖維素的酶解效率的重要途徑,是木質(zhì)纖維素生物轉(zhuǎn)化過程中不可缺少的步驟。在眾多預(yù)處理方法之中,熱水(liquid hot water,LHW)預(yù)處理具有不添加任何化學(xué)試劑、環(huán)境友好、可有效提高秸稈等原料酶解效率等優(yōu)點(diǎn),使其具有較高的應(yīng)用價(jià)值。但熱水預(yù)處理后,物料中仍含有較多的木質(zhì)素。同時(shí)預(yù)處理過程中引起的木質(zhì)素結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的變化,也將影響木質(zhì)素對纖維素酶的吸附,從而影響纖維素酶解的效率。但迄今為止,對木質(zhì)素吸附對不同纖維素酶組分的影響規(guī)律、木質(zhì)素與不同纖維素酶的結(jié)合機(jī)制、預(yù)處理對木質(zhì)素吸附纖維素酶的影響及其影響機(jī)制等方面仍缺乏深入的認(rèn)識(shí),對如何減少木質(zhì)素對纖維素酶的非生產(chǎn)性吸附也缺乏理論指導(dǎo)�；谝陨媳尘�,本論文在預(yù)處理對木質(zhì)素吸附纖維素酶的影響及其機(jī)制、木質(zhì)素對纖維素酶系和主要纖維素酶組分的吸附性質(zhì)、木質(zhì)素與不同酶的結(jié)合機(jī)制、通過酶分子改造減少木質(zhì)素對酶吸附性能、以及木質(zhì)素對不同酶的吸附對酶解的影響等方面開展了系統(tǒng)的研究工作,并取得良好進(jìn)展。研究對通過對纖維素酶系的優(yōu)化、對不同酶分子進(jìn)行理性改造、尋找合理的預(yù)處理方法等途徑,減少木質(zhì)素對纖維素酶和酶解的不利影響,提高木質(zhì)纖維素酶解效率具有重要理論指導(dǎo)意義,對通過酶的理性改造提高酶對纖維素的結(jié)合以促進(jìn)底物的降解、以及如何提高纖維素酶的回收利用等也具有較好的參考價(jià)值。本論文的主要研究內(nèi)容和取得的結(jié)果如下:(1)不同熱水預(yù)處理強(qiáng)度的木質(zhì)素對纖維素酶系的吸附性質(zhì)玉米秸稈進(jìn)行不同強(qiáng)度的熱水預(yù)處理(預(yù)處理強(qiáng)度分別為3.6,3.9和4.2)后,提取預(yù)處理底物中的木質(zhì)素,對其理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn):與未預(yù)處理原料中的木質(zhì)素相比,預(yù)處理后木質(zhì)素分子量增加,多分散性降低,酚羥基和脂肪族羥基數(shù)量增加,而甲基和亞甲基數(shù)量減少,木質(zhì)素的電負(fù)性和疏水性也發(fā)生變化。比較預(yù)處理前后木質(zhì)素對纖維素酶的吸附性質(zhì)發(fā)現(xiàn),熱水預(yù)處理增強(qiáng)了木質(zhì)素對纖維素酶的吸附。分析發(fā)現(xiàn),木質(zhì)素性質(zhì)和結(jié)構(gòu)的變化可能是造成預(yù)處理前后木質(zhì)素對纖維素酶吸附出現(xiàn)差異的原因,例如:預(yù)處理后木質(zhì)素表面疏水性的增加,有利于木質(zhì)素和酶的疏水性結(jié)合;木質(zhì)素表面負(fù)電荷的增加,增加了纖維素酶-木質(zhì)素之間的靜電引力;而一些化學(xué)基團(tuán)的變化,如酚羥基數(shù)量的增加也是促進(jìn)木質(zhì)素-酶結(jié)合的因素。通過SDS-PAGE、酶譜等結(jié)合LC-MS/MS等方法,對木質(zhì)素吸附纖維素酶前后上清液中的主要蛋白進(jìn)行定性和定量分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),木質(zhì)素對纖維素酶系中不同酶組分的吸附特征存在明顯差異:木質(zhì)素對草酸青霉纖維素酶系中不同酶組分的吸附量呈現(xiàn)如下規(guī)律:CBHEGBgl和Xylanase(依次為外切葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和木聚糖酶)。其中,在木質(zhì)素對CBH和Bgl的吸附中,疏水性作用是影響木質(zhì)素對蛋白吸附的主要因素;而對EG和Xylanase的吸附中,靜電作用力對吸附的影響較大。(2)木質(zhì)素對主要纖維素酶組分的吸附性質(zhì)及機(jī)制通過對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的綜合分析,結(jié)合生物信息學(xué)模擬,研究了木質(zhì)素對纖維素酶系中主要酶組分(CBHⅠ,EGⅡ和Bgls)的吸附性質(zhì)和機(jī)制。通過分析CBH Ⅰ在木質(zhì)素表面的結(jié)合強(qiáng)度及其酶活變化,發(fā)現(xiàn)CBH Ⅰ與木質(zhì)素之間能夠形成比較穩(wěn)定的結(jié)合,離心、洗滌等方式難以將木質(zhì)素與被吸附的蛋白分離,形成了“木質(zhì)素-CBHⅠ”結(jié)合體。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),“木質(zhì)素-CBHⅠ”結(jié)合體依然具有降解纖維素底物的能力。通過分子對接對木質(zhì)素-CBHⅠ結(jié)合位點(diǎn)的分析發(fā)現(xiàn),木質(zhì)素在CBH Ⅰ的催化結(jié)構(gòu)域(CD區(qū))的結(jié)合主要集中在非催化孔道的疏水性裂縫中,因此木質(zhì)素對CD區(qū)的吸附不影響酶對纖維素的結(jié)合和酶解。CBHⅠ的CBM(纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域)也在酶與木質(zhì)素的結(jié)合中起到重要作用。通過分析CBM與木質(zhì)素最佳結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸分布發(fā)現(xiàn),靜電作用推動(dòng)了木質(zhì)素對蛋白的吸附,其中57位的賴氨酸(Lys57)在吸附中起到重要作用。改變CBM區(qū)的帶電性質(zhì),將帶正電荷的氨基酸Lys57點(diǎn)突變?yōu)閹ж?fù)電荷的氨基酸Glu57,可以減少木質(zhì)素對CBM區(qū)的吸附,而不影響CBM區(qū)與纖維素的結(jié)合。比較木質(zhì)素對EG Ⅱ和CBHⅠ的吸附動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)過程發(fā)現(xiàn),木質(zhì)素對EGⅡ的吸附速率和吸附量都低于CBHⅠ。但是,對結(jié)合至木質(zhì)素表面的EGⅡ酶活性質(zhì)的分析表明,木質(zhì)素對EGⅡ的吸附影響了酶對底物的結(jié)合,降低了 EGⅡ的活性。利用Auotodock對木質(zhì)素與EGⅡ的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行了預(yù)測,表明木質(zhì)素對EG Ⅱ的CD區(qū)的吸附區(qū)域與纖維多糖的吸附區(qū)域重合,都位于CD區(qū)開放的催化通道內(nèi),因此木質(zhì)素對EGⅡ的吸附影響了酶對纖維多糖的結(jié)合和水解。由此推測,在木質(zhì)纖維素的酶解中,木質(zhì)素對EG的吸附可能是其影響纖維素酶水解效率的主要途徑。通過比較草酸青霉的Bgll和煙曲霉的Bg13在木質(zhì)素/纖維素上的吸附性質(zhì)發(fā)現(xiàn):木質(zhì)素對Bg13的吸附較強(qiáng),而纖維素對Bgl3的吸附較弱;木質(zhì)素對Bgll的吸附較弱,而Bgll可以結(jié)合到纖維素的表面。對于木質(zhì)素對草酸青霉的Bgll和煙曲霉的Bg13的吸附性能為何存在較大差異的原因,目前尚沒有文獻(xiàn)報(bào)道。通過生物信息學(xué)分析和對Bgls的FnⅢ區(qū)的點(diǎn)突變,證明了 FnⅢ區(qū)在Bg13與木質(zhì)素的結(jié)合中起到重要作用,同時(shí)還發(fā)現(xiàn),Bg13-FnⅢ表面的正電荷可能是促進(jìn)蛋白與木質(zhì)素結(jié)合的主要?jiǎng)恿?增加pH值(由4.8提高至6.5),可以減少Bg13表面的正電荷,減少木質(zhì)素對Bg13的吸附。比較Bgll和Bgl3的FnⅢ區(qū)表面電荷和氨基酸的分布發(fā)現(xiàn),這兩個(gè)蛋白的FnⅢ區(qū)的差異可能是引起木質(zhì)素對不同Bgls吸附性質(zhì)差異的原因。(3)纖維素酶分子的理性改造對木質(zhì)素吸附的影響在木質(zhì)素對纖維素酶的吸附機(jī)制研究基礎(chǔ)上,對CBH Ⅰ和EGⅡ的CBM區(qū)以及Bgls的FnⅢ區(qū)進(jìn)行點(diǎn)突變和融合等的改造,對比了改造前后木質(zhì)素對不同纖維素酶吸附性質(zhì)的變化以及對酶解性能的影響。將三點(diǎn)突變的T.r-CBMV27E,P30D,Linkl(突變的里氏木霉CBH Ⅰ的CBM區(qū))分別與CBHⅠ和EGⅡ融合,結(jié)果發(fā)現(xiàn),嵌合蛋白CBH-CBMV27E,P30D,Linkl和EG-TrCBMV27E,P30D,Linkl對底物表現(xiàn)出較高的酶解能力。SEM觀察發(fā)現(xiàn),酶解過程中CBH-CBMV27E,P30D,Link1和EG-TrCBMV27E,P30D,Link1對纖維底物破壞能力增強(qiáng),酶解后暴露出更多的纖維素酶結(jié)合位點(diǎn),這可能是其具有較高酶解能力的原因。將Bgl3的FnⅢ區(qū)與Bgl1的催化結(jié)構(gòu)域融合,得到的嵌合蛋白Bgl1-3。與Bgl1相比,Bgl1-3對木質(zhì)素的吸附親和力增加,而對纖維素的吸附親和力降低。但嵌合蛋白Bgl1-3具有較高的酶解能力,進(jìn)一步證明了 FnⅢ區(qū)在Bgls對底物結(jié)合中的重要作用。在CBH/Bgls共存的反應(yīng)體系中,加入Bgls減少了 CBH在木質(zhì)素和微晶纖維素等底物上的吸附量。由于Bgls的酶解底物是纖維二糖而非纖維素,因此纖維素對Bgls的吸附可能并不利于酶解的進(jìn)行,這可能是纖維素對Bgl1-3具有較低的吸附,但是Bgl1-3卻具有較高酶解能力的原因之一。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：O636.2;Q55
【部分圖文】：

在過去的研宄中，人們己經(jīng)發(fā)現(xiàn)了很多不同的預(yù)處理方法，大體上可以分為??化學(xué)法、物理法、理化法、生物法以及不同預(yù)處理方法的組合。雖然目前不同預(yù)??處理對底物化學(xué)成分、物理結(jié)構(gòu)的修飾或改變的研究還不充分，但是所有預(yù)處理??方法的目的都是打破底物結(jié)構(gòu)，去除底物中對酶解有害的成分，從而實(shí)現(xiàn)提高酶??解效率，增加酶解產(chǎn)量的目的。??理想的預(yù)處理方法可以使得纖維素、半纖維素和木質(zhì)素充分的分離，從而將??纖維素完全暴露，有利于纖維素酶對纖維素的結(jié)合和酶解。半纖維素主要位于纖??維的表面和纖維素簇之間，在預(yù)處理中是最易改變和溶出的物質(zhì)（Ｃｈａｎｄｒａ?ｅｔ?ａｌ．，??２００７）。但是，木質(zhì)素為了保護(hù)木質(zhì)纖維素免受外界的侵蝕，以矩陣狀分布于纖??維素間，加強(qiáng)了纖維素結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，很難從纖維素中分離出來（Ｇｉｌ?ｅｔａｌ．，?２０１０）。??很多預(yù)處理技術(shù)是以去除或改變底物中的木質(zhì)素成分為目的（Ｈｉｍｍｅ丨ｅｔ?ａｌ．，２００７；??Ｌｉ?＆?Ｚｈｅｎｇ，?２０１７）。但是，從成本上考慮，大多數(shù)預(yù)處理方法都很難去除原料中??

態(tài)；Ｃ：木質(zhì)素的基本結(jié)構(gòu)：基本組分和主要化學(xué)鍵。??Ｆｉｇ?１－２?Ｔｈｅ?ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ?ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ?ａｎｄ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｏｆ?ｌｉｇｎｉｎ?ｉｎ?ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ．?Ａ：?ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ??ｏｆ?ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ；?Ｂ：?ｌｉｇｎｉｎ?ｉｓｏｌａｔｅｄ?ｆｒｏｍ?ｐｏｐｌａｒ；?Ｃ：?ｔｈｅ?ｂａｓｉｃ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｏｆ?ｌｉｇｎｉｎ（Ｌｉ?ｅｔ?ａｌ．，?２０１６）．??１．１．２不同預(yù)處理對木質(zhì)素結(jié)構(gòu)的影響??１．１．２．１酸預(yù)處理對木質(zhì)素結(jié)構(gòu)的影響??Ｍｅｎｇ等認(rèn)為稀酸預(yù)處理是比水和堿預(yù)處理更為有效的預(yù)處理方法。稀酸預(yù)??處理后底物的表層微纖維間出現(xiàn)了納米孔，增加了纖維素酶與底物的接觸面積，??促進(jìn)了酶解的進(jìn)行（Ｍｅｎｇ?ｅｔａｌ．，?２０１５）。但是稀酸預(yù)處理后，大量的木質(zhì)素殘留在??底物中，而且酸性預(yù)處理后的木質(zhì)素對纖維素材料的酶解有明顯的抑制作用。預(yù)??處理中木質(zhì)素理化性質(zhì)的變化可能促進(jìn)了木質(zhì)素對酶解的影響。Ｈｕａｎｇ等發(fā)現(xiàn)，??稀酸預(yù)處理明顯的改變了木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)：分子量增加，分子均一性增加，同時(shí)木??，ｕａｎａ．。??

?Ｍｉ??ＯＨ??圖１－２木質(zhì)素的作用及基本結(jié)構(gòu)：Ａ：木質(zhì)素在木質(zhì)纖維素中的分布；Ｂ：木質(zhì)素的基本形??態(tài)；Ｃ：木質(zhì)素的基本結(jié)構(gòu)：基本組分和主要化學(xué)鍵。??Ｆｉｇ?１－２?Ｔｈｅ?ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ?ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ?ａｎｄ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｏｆ?ｌｉｇｎｉｎ?ｉｎ?ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ．?Ａ：?ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ??ｏｆ?ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ；?Ｂ：?ｌｉｇｎｉｎ?ｉｓｏｌａｔｅｄ?ｆｒｏｍ?ｐｏｐｌａｒ；?Ｃ：?ｔｈｅ?ｂａｓｉｃ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｏｆ?ｌｉｇｎｉｎ（Ｌｉ?ｅｔ?ａｌ．，?２０１６）．??１．１．２不同預(yù)處理對木質(zhì)素結(jié)構(gòu)的影響??１．１．２．１酸預(yù)處理對木質(zhì)素結(jié)構(gòu)的影響??Ｍｅｎｇ等認(rèn)為稀酸預(yù)處理是比水和堿預(yù)處理更為有效的預(yù)處理方法。稀酸預(yù)??處理后底物的表層微纖維間出現(xiàn)了納米孔，增加了纖維素酶與底物的接觸面積，??促進(jìn)了酶解的進(jìn)行（Ｍｅｎｇ?ｅｔａｌ．，?２０１５）。但是稀酸預(yù)處理后，大量的木質(zhì)素殘留在??底物中，而且酸性預(yù)處理后的木質(zhì)素對纖維素材料的酶解有明顯的抑制作用。預(yù)??處理中木質(zhì)素理化性質(zhì)的變化可能促進(jìn)了木質(zhì)素對酶解的影響。Ｈｕａｎｇ等發(fā)現(xiàn)，??稀酸預(yù)處理明顯的改變了木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)：分子量增加，分子均一性增加，同時(shí)木??質(zhì)素發(fā)生了聚合反應(yīng)，表面的疏水性和負(fù)電荷數(shù)量都明顯增加（Ｈｕａｎｇ?ｅｔａｌ．，?２０１６）。??同時(shí)
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;A novel function for the cellulose binding module of cellobiohydrolase I[J];Science in China(Series C:Life Sciences);2008年07期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 胡益波;青霉G蛋白信號通路對糖苷水解酶合成調(diào)控初探及其在構(gòu)建表達(dá)系統(tǒng)中的應(yīng)用[D];山東大學(xué);2015年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 王菲菲;不同預(yù)處理方法對玉米秸稈木質(zhì)素吸附纖維素酶特征的影響[D];山東大學(xué);2014年

本文編號：2876602