近年來,隨著全球獸藥殘留問題日趨嚴(yán)峻,各類新型檢測技術(shù)得到了迅猛發(fā)展。在這些技術(shù)中,基于核酸適體的標(biāo)記型電化學(xué)傳感器表現(xiàn)出操作簡單、無試劑化、可重復(fù)使用、在復(fù)雜基質(zhì)中工作能力強(qiáng)且可與生物芯片相兼容等諸多優(yōu)點(diǎn),易于實(shí)現(xiàn)微型化和在線監(jiān)測,與其他技術(shù)相比,通過基礎(chǔ)功能參數(shù)性能的改良,將更有利于實(shí)際應(yīng)用化,極具研究開發(fā)價(jià)值,是未來發(fā)展的重要方向之一。本文以核酸DNA適體-卡那霉素A(KMY-A)特異性作用體系為研究對象,通過探針自組裝結(jié)構(gòu)變化,定向設(shè)計(jì)并構(gòu)建了三類分別基于單、雙和三探針組合5種不同構(gòu)型的電化學(xué)傳感器,系統(tǒng)研究了構(gòu)型變化對改善靈敏度的影響,成功實(shí)現(xiàn)了通過構(gòu)型變化調(diào)控和有效提高傳感器信號增益率(SE%)或絕對檢測信號值(DS)和基礎(chǔ)功能如檢測限、響應(yīng)速度和選擇性等參數(shù)性能的目標(biāo)。具體工作分述如下:一、基于目標(biāo)物誘導(dǎo)構(gòu)型變化信號機(jī)制構(gòu)建了一種單探針體系傳感器(S-1)。實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了探針密度、支持溶劑鏈長度、工作介質(zhì)離子強(qiáng)度和檢測溫度4個影響傳感器構(gòu)建和工作效率的關(guān)鍵參數(shù)。在優(yōu)化條件下,該傳感器用于KMY-A檢測,添加2.0 m M濃度下SE%為226.1±8.0%;線性范圍為1.0μM~1.0m M,檢測限為0.33μM;對其他5種非同類結(jié)構(gòu)抗生素分子表現(xiàn)出較好的區(qū)分度,區(qū)分系數(shù)介于-0.002~0.019之間,對同類結(jié)構(gòu)同系物卡那霉素B(KMY-B)表現(xiàn)出一定的區(qū)分度,區(qū)分系數(shù)為0.90;響應(yīng)時間為~15 s,顯示出超快的傳感速度;用于三類目標(biāo)物殘留常見實(shí)際樣品牛奶、自來水和血清的分析評價(jià),SE%值分別為116.2±7.2、172.7±8.7和81.7±5.8,表現(xiàn)出較好的工作性能。二、針對S-1因捕獲信號探針(CSP-MB)自由彈性擺動導(dǎo)致背景電流相對較高的缺點(diǎn),通過引入支撐輔助探針(AP)設(shè)計(jì)并構(gòu)建了基于目標(biāo)物誘導(dǎo)取代反應(yīng)信號機(jī)制的雙探針體系傳感器(S-2)。該傳感器借助輔助雙鏈作用有效限制了CSP的自由彈性擺動,從而降低背景電流,相對提高檢測靈敏度。實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了AP和CSP的比例、混合探針濃度、AP/CSP雙鏈位置和AP長度4個影響傳感器構(gòu)建和工作效率的關(guān)鍵參數(shù)。在優(yōu)化條件下,該傳感器用于KMY-A檢測,添加2.0 m M濃度下SE%為502.1±26.0%;線性范圍為5.0 n M~10.0μM,檢測限為1.7 n M;對其他5種非同類結(jié)構(gòu)抗生素分子區(qū)分系數(shù)介于-0.002~0.009之間,對KMY-B區(qū)分系數(shù)為0.84;響應(yīng)時間為~240 s;用于實(shí)際樣品牛奶、自來水和血清的分析評價(jià),其SE%值分別為176.5±15.2%、407.4±21.0%和126.9±14.0%。除響應(yīng)速度外,該傳感器的總體性能好于S-1。三、可以預(yù)測,呈莖環(huán)變化構(gòu)型帶動亞甲基藍(lán)(MB)標(biāo)記物的效率會高于CSP轉(zhuǎn)變?yōu)镃SP/KMY-A復(fù)合物變化構(gòu)型,有利于提高SE%,進(jìn)而改善靈敏度�；诖�,以適體為捕獲探針(CP),一段自身呈莖環(huán)型結(jié)構(gòu)DNA為輔助兼信號探針(ASP),設(shè)計(jì)并成功構(gòu)建了基于目標(biāo)物誘導(dǎo)莖環(huán)“開關(guān)”信號機(jī)制的雙探針體系傳感器(S-3)。實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了CP和ASP的比例、混合探針濃度、CP/ASP雙鏈長度和檢測溫度4個影響傳感器構(gòu)建和工作效率的關(guān)鍵參數(shù)。在優(yōu)化條件下,該傳感器用于KMY-A檢測,添加2.0 m M濃度下SE%為801.1±32.0%;線性范圍為2.5 n M~10.0μM,檢測限為0.83 n M;對其他5種非同類結(jié)構(gòu)抗生素分子區(qū)分系數(shù)介于0.0005~0.0071之間,對KMY-B區(qū)分系數(shù)為0.64;響應(yīng)時間為~60 s;用于實(shí)際樣品牛奶、自來水和血清的分析評價(jià),其SE%值分別為342.9±15.2%、665.4±21.0%和260.3±18.2%。四、前三種傳感器均采用MB標(biāo)記探針限定在電極表面的方式。該方式因?qū)B固定在電極表面一定范圍內(nèi),背景電流難以有效降低。為解決這一問題,借助信號探針(SP)游離的思路設(shè)計(jì)并構(gòu)建了基于目標(biāo)物誘導(dǎo)SP轉(zhuǎn)移信號機(jī)制的“雙撐型”三探針體系傳感器(S-4)。在該傳感器結(jié)構(gòu)中,CP/AP雙鏈采用“雙撐”方式共嫁接于金電極表面,SP游離于溶液體系。實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了CP和AP比例、混合探針濃度、SP濃度、AP長度和檢測溫度5個影響傳感器構(gòu)建和工作效率的關(guān)鍵參數(shù)。在優(yōu)化條件下,該傳感器用于KMY-A檢測,添加2.0 m M濃度下DS值為0.81±0.08μA,SE%為35000±6250%;線性范圍為100 p M~1.0μM,檢測限為30 p M;對其他5種非同類結(jié)構(gòu)抗生素分子區(qū)分系數(shù)介于-0.004~0.0021之間,對KMY-B區(qū)分系數(shù)為0.49;響應(yīng)時間為~15 min;用于實(shí)際樣品牛奶、自來水和血清的分析評價(jià),其DS值分別為純工作介質(zhì)中DS值的44.4±3.6%、48.1±4.2%和26.0±2.8%。五、在S-4結(jié)構(gòu)上進(jìn)行適當(dāng)變化,將CP/AP雙鏈采用“單撐”方式即僅AP嫁接于金電極表面構(gòu)建了S-5傳感器。該傳感器呈現(xiàn)出與S-4完全相反的雜交阻力減小的作用模式,有效提高了傳感效率,改善了傳感綜合性能。在優(yōu)化條件下,該傳感器用于KMY-A檢測,添加2.0 m M濃度下DS值為1.98±0.12μA,SE%為70000±8850%;線性范圍為10 p M~1.0μM,檢測限為3.3 p M;對其他5種非同類結(jié)構(gòu)抗生素分子區(qū)分系數(shù)介于-0.0012~0.0005之間,對KMY-B區(qū)分系數(shù)為0.47;響應(yīng)時間為~9 min;用于實(shí)際樣品牛奶、自來水和血清的分析評價(jià),其DS值分別為純工作介質(zhì)中DS值的46.2±3.2%、65.0±4.0%和40.1±2.8%。
【學(xué)位單位】：哈爾濱理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：O657.1
【部分圖文】：

圖 1-1 適體篩選技術(shù)流程圖Fig. 1-1 Scheme for the SELEX1.2.3 傳感器分類與結(jié)構(gòu)電化學(xué)技術(shù)被廣泛地用于食品和水中污染物的檢測[41-45]。因其檢測成本低、操作簡單快速、攜帶方便、易微型化和實(shí)現(xiàn)在線監(jiān)測，具有極好的應(yīng)用化和商業(yè)化前景，與其他技術(shù)相比，顯示出明顯的優(yōu)勢。根據(jù)輸出參數(shù)如阻抗、電流和電位，電化學(xué)適體傳感器一般可對應(yīng)分為三種類型，即阻抗型傳感器、電流型（安培/伏安）傳感器和電位（電勢）型傳感器。這些檢測技術(shù)與適體篩選技術(shù)相結(jié)合，極大地促進(jìn)了適體傳感器的發(fā)展，為解決復(fù)雜基質(zhì)樣品中各類污染物分析提供了可行解決方案[46-50]。電化學(xué)適體傳感器一般結(jié)構(gòu)如圖 1-2 所示。全部系統(tǒng)主要由敏感分子識別元件和轉(zhuǎn)換器兩部分組成。轉(zhuǎn)換器部件一般又包括修飾層、電極基底和電學(xué)系統(tǒng)三部分。用作修飾層的物質(zhì)如有機(jī)分子、導(dǎo)電聚合物和納米材料等起著適體和基底的連接作用，可有效改善電子傳遞效率實(shí)現(xiàn)電信號的擴(kuò)增。用作基底的一般是由不同材料做成的電極，如金電極（AuE）、玻碳電極（GCE）、銦錫氧

圖 1-2 電化學(xué)適體傳感器結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1- 2 the schematic diagram of E-aptasensor construction1.3 卡那霉素電化學(xué)適體傳感器研究進(jìn)展卡那霉素是氨基糖苷類抗生素的重要亞類之一，廣泛應(yīng)用于治療革蘭陽性和革蘭陰性菌引起的嚴(yán)重感染，在臨床和畜牧中均有應(yīng)用。在實(shí)際生產(chǎn)和生活中，過度使用和濫用以及對其廢棄物不合理處置等常會導(dǎo)致食品如牛奶、飲用水和人體內(nèi)含有一定的殘留。長期接觸或食用含有卡那霉素殘留的物品或食品可引起人耳毒性、腎毒性和耐藥性，造成人體正常生理功能紊亂，危害人體健康[53]。為提前預(yù)防并及時消除這些潛在的危害影響，建立既快速又準(zhǔn)確的分析方法實(shí)現(xiàn)對卡那霉素殘留水平的監(jiān)測具有重要意義[54]。近 5 年來，隨著適體篩選技術(shù)的發(fā)展和卡那霉素適體的報(bào)導(dǎo)，采用核酸適體為分子識別元件的電化學(xué)卡那霉素適體傳感器的研究引起了人們廣泛關(guān)注，共有 13 個[55-67]相關(guān)工作進(jìn)行了報(bào)導(dǎo)，具體參數(shù)總結(jié)對比列于表 1-1，分別為采用阻抗技術(shù)和三種伏安技術(shù)即差分脈沖伏安技術(shù)（DPV）、方波伏安技術(shù)（SWV）

圖 1-3 卡那霉素適體傳感器的表面修飾和構(gòu)建示意圖[55]Fig.1- 3 Schematic diagram of surface modification and fabrication of kanamycin aptasensor[5.3.2 電流型適體傳感器.3.2.1 基于 LSV 技術(shù) LSV 是一種電化學(xué)伏安法技術(shù)。其做法是在電解池和電極之間施加一個線性電位掃描（電位與時間為線性關(guān)系）。在具體測試中現(xiàn)單次和多次掃描。依據(jù)測定獲得的電流-電位曲線上峰電流與目標(biāo)物之間性關(guān)系可進(jìn)行定量分析，比較適合于發(fā)生吸附反應(yīng)的測定，因而在傳感器一定的應(yīng)用[70]。韓國釜山國立大學(xué)化學(xué)系 Zhu Y[56]研究組采用在金電極表飾導(dǎo)電聚合物聚-[2,5-二-(2-噻吩基)-1H-吡咯-1-(p-苯甲酸)]（poly-DPB）來電子傳遞效率并借助 EDC:NHS 化學(xué)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)適體耦合，構(gòu)建了基于 LSV的適體傳感器（圖 1-4）。DPB 在金電極表面的自組裝過程采用掃描電鏡（TEM術(shù)和紫外-可見光譜（UV-vis）進(jìn)行觀察，適體修飾過程以光電子能譜（XP術(shù)和電化學(xué)阻抗（EIS）技術(shù)進(jìn)行表征，采用 LSV 技術(shù)進(jìn)行定量測定。在條件下，該傳感器對目標(biāo)物檢測獲得了 0.05-9.0 μM 的線性范圍和 9.4±0.4 n檢測限。
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 察冬梅;;淺議靈敏度、檢出限和測定限[J];大學(xué)化學(xué);2011年04期

本文編號：2870626