植物甾醇是一種重要的具有生理活性的固醇類化合物,具有降低血液中膽固醇濃度、抗癌、抗氧化、類激素等作用,植物甾醇及其衍生物被廣泛用于保健食品、藥品以及化妝品中。酵母中麥角固醇的含量較高,麥角固醇與植物甾醇具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu),其生物合成途徑中有植物甾醇合成的前體物質(zhì)麥角-5,7-二烯醇,因此通過基因工程的手段改造麥角固醇合成途徑合成植物甾醇成為可能。本研究建立了一種用GC-MS/SIM檢測(cè)微生物中甾醇類化合物的方法;并以解脂亞羅酵母(Yarrowia lipolytica polf)為宿主,構(gòu)建了一株產(chǎn)菜油甾醇的菌株YL-PE,鑒別了其發(fā)酵產(chǎn)物,考察了菜油甾醇的合成量。Y.lipolytica是一種產(chǎn)油微生物,胞內(nèi)油脂能為甾醇類物質(zhì)提供存儲(chǔ)空間,緩解過量甾醇累積對(duì)細(xì)胞膜流動(dòng)性造成的影響,同時(shí),胞內(nèi)油脂的合成與菜油甾醇又共用乙酰CoA等前體物質(zhì),因此,細(xì)胞中油脂對(duì)菜油甾醇的合成既有促進(jìn)又有競(jìng)爭(zhēng)作用。如何充分利用油脂對(duì)甾醇合成的有利因素,是進(jìn)一步提高甾醇積累量的基礎(chǔ)理論問題。本研究在不同油脂產(chǎn)量的菌株中構(gòu)建了菜油甾醇的合成途徑,研究了油脂產(chǎn)量與菜油甾醇積累之間的關(guān)系,并構(gòu)建轉(zhuǎn)化DHCR7的多拷貝質(zhì)粒進(jìn)一步提高了菜油甾醇的產(chǎn)量,發(fā)酵罐發(fā)酵考察了最優(yōu)菌株中菜油甾醇的產(chǎn)量,取得的主要研究結(jié)果如下:(1)以甾醇混合標(biāo)樣與Y.lipolytica polf發(fā)酵液樣品為檢測(cè)對(duì)象,建立了一種基于GC-MS/SIM檢測(cè)微生物中甾醇類化合物的方法。此方法下各色譜峰之間分離度R均大于1.2;SIM模式下各待測(cè)組分在3-200μg/mL之間具有較好的線性關(guān)系,各組分的檢出限大于5.0 μg/mL;精密度、穩(wěn)定性和加標(biāo)回收率結(jié)果顯示,此方法多次測(cè)定樣品RSD為8.14%,48 h內(nèi)樣品之間的RSD為6.96%,不同梯度的加標(biāo)回收率在80.69-91.41%之間。方法驗(yàn)證結(jié)果說明此方法具有較好的分離度、線性范圍、重復(fù)性、穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度,能滿足檢測(cè)酵母中甾醇類化合物的要求。(2)以Y.lipolyticapolf為宿主,敲除了麥角固醇合成途徑中ERG5基因,表達(dá)了來自非洲爪蟾的DHCR7基因,構(gòu)建了一株能合成菜油甾醇的解脂亞羅酵母菌株YL-PE。經(jīng)過鑒定對(duì)照菌株po1f、po1f-ERG5-和重組菌株YL-PE發(fā)酵產(chǎn)物,發(fā)現(xiàn)敲除ERG5使麥角固醇的合成停留在麥角-5,7-二烯醇,并且對(duì)宿主的生長(zhǎng)有抑制作用,表達(dá)DHCR7基因使麥角-5,7-二烯醇轉(zhuǎn)化成菜油甾醇;重組菌株YL-PE搖瓶發(fā)酵得到菜油甾醇的產(chǎn)量為485 μg/g;在5 LBioflo發(fā)酵罐發(fā)酵菜油甾醇的最大產(chǎn)量為15.2 mg/L。(3)以三株不同油脂產(chǎn)量的菌株(po1f、po1f-mfe-、po1f-pex10--mfe-)為宿主,研究油脂對(duì)菜油甾醇合成量的影響,并進(jìn)一步表達(dá)DHCR7多拷貝質(zhì)粒提高菜油甾醇的積累。結(jié)果發(fā)現(xiàn),三個(gè)油脂含量依次增高的菌株(po1f-mfe--ERG5-、po1f-ERG5-、po1f-pex10--mfe--ERG5-)中,菜油甾醇的合成量分別為 757.8、480 和 589.9μg/g。其中,po1f-mfe--ERG5-菌株中菜油甾醇的產(chǎn)量最高為757.8μg/g,其油脂含量最少(42.3 mg/g),因此,菜油甾醇產(chǎn)量與油脂積累量沒有顯現(xiàn)出直接的對(duì)應(yīng)關(guān)系,可能是因?yàn)殓薮籍a(chǎn)量較小,并沒有以酯化形式存儲(chǔ)于油脂中,使油脂提高甾醇產(chǎn)量的作用未能充分體現(xiàn)。同時(shí)發(fā)現(xiàn),敲除MFE的菌株中,菜油甾醇產(chǎn)量均高于對(duì)照菌株po1f-ERG5-,細(xì)胞可能通過提高菜油甾醇的合成參與細(xì)胞膜的修復(fù),緩解敲除MFE帶來的損傷。另外,增加DHCR7拷貝數(shù)提高了DHCR7和ERG4相對(duì)表達(dá)量,使得碳代謝更多的流向菜油甾醇,顯著提高了菜油甾醇的合成量。多拷貝質(zhì)粒表達(dá)菌株中po1f-pex10--mfe--ERG5-菜油甾醇的產(chǎn)量最高,可達(dá)1062 μg/g DCW,發(fā)酵罐發(fā)酵得到49.2 mg/L菜油甾醇。綜上,本研究建立了一種用GC-MS/SIM法檢測(cè)微生物中甾醇類化合物的方法,構(gòu)建了合成菜油甾醇的菌株YL-PE,并發(fā)現(xiàn)通過敲除MFE基因、增加DHCR7拷貝數(shù)是提高生物合成菜油甾醇產(chǎn)量的有效途徑,研究結(jié)果為利用重組酵母生產(chǎn)菜油甾醇奠定了應(yīng)用基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：陜西師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：TQ929;O629.21
【部分圖文】：

２．４．２方法專屬性的考察??對(duì)甾醇的混合標(biāo)準(zhǔn)品在選定條件下分析得到甾醇混合標(biāo)準(zhǔn)品的總離子流圖??（Ｔｏｔａｌｉｏｎｃｕｒｒｅｎｔ，?ＴＩＣ）如圖２－１，由總離子流圖可以看出，在當(dāng)前選定的條件下??內(nèi)標(biāo)物膽甾烷醇、麥角固醇、菜油甾醇、豆甾醇和Ｐ谷甾醇峰形良好。各甾醇的質(zhì)??譜圖引入到ＮＩＳＴ譜庫中檢索，與標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖的相似度均在９８％以上。各個(gè)組分的??保留時(shí)間及色譜峰之間的分離度見表２－１，除了麥角固醇和菜油甾醇的分離度為??１．２９，說明麥角固醇和菜油甾醇能基本分離，其余組分分離度均大于１．５，證明此??條件下可以檢測(cè)此五種甾醇，并且有較好的分離度。??１２００００００?－?ｌ．?ｃｈｏｌｃｓｔａｎｏｌ??－?１?２．?ｅｒｇｏｓｔｅｒｏｌ??１０００００００?－?３．?ｃａｍｐｅｓｔｅｒｏｌ??�。矗�?ｓｔｉｇｍａｓｔｃｒｏｌ??５．?ｐ?－ｓｉｔｏｓｔｅｒｏｌ??＾?ｅｕｕｕｕｕｕ?ｈ?Ｉ?５??氣。２?３?ｆ?Ｉ??■?５！?Ｉ?Ｉ１??２００００００?－?｜｜?ｊｌ?Ｉ?丨Ｉ??Ａ?丨?ｉ?ｆｉ?１１?Ｉ?ｊｉ??＾＾??八．＿?＿???／＼Ｊ?＾－?－－—??〇?Ｉ?＜?Ｉ?■?Ｉ?■?？?■?？?■?Ｉ?■?Ｉ?■?Ｉ?■?Ｉ?■?Ｉ?■?Ｉ?？?？??１１?１２?１３?１４?１５?１６?１７?１８?１９?２０?２１??Ｒｅｌｅｔｉｏｎ?Ｔｉｍｅ?（ｍｉｎ）??圖２－

．、在宿主菌Ｋ／少ｏ／：＾ｃａｐｏｌｆ中轉(zhuǎn)入線性化之后的敲除載體在ＳＤ－ＵＲＡ上培養(yǎng)４天，接下來對(duì)敲除菌株提取基因組ＤＮＡ進(jìn)行ＰＣＲ驗(yàn)證，對(duì)于得到的陽性菌株要去掉染色體上的ｍａｒｋｅｒ－Ｕｒａ３［９７］，具體流程見圖２－１。??（１）利用ｐｌｏｘｐ－ｕｒａ３－ｌｏｘｐ為載體構(gòu)建敲除質(zhì)粒；??（２）將構(gòu)建好的敲除質(zhì)粒選擇合適的酶切位點(diǎn)線性化，轉(zhuǎn)入Ｘ／ｉｐｏ／ｙｒｉｃ；??（３）對(duì)ＳＤ－ｕｒａ平板上長(zhǎng)出的菌落，挑取單菌落接種到２ｍＬＹＰＤ液體，于２８°Ｃ１８０ｒ／ｍｉｎ在搖床中培養(yǎng)２４ｈ，提取待驗(yàn)證菌株基因組ＤＮＡ，的引物進(jìn)行ＰＣＲ分別擴(kuò)增敲除基因的上下游，驗(yàn)證雙交換的結(jié)果；??（４）驗(yàn)證目的基因成功敲除的菌株，轉(zhuǎn)入ｐＪＮ４４－ｃｒｅ，此質(zhì)粒中ｅｒｅ蛋ｕｒａ３基因兩端上的ＬｏｘＰ位點(diǎn)，表達(dá)Ｃｒｅ就可以對(duì)Ｍａｒｋｅｒ－ｕｒａ３進(jìn)行定向（５）利用ＰＣＲ擴(kuò)增驗(yàn)證ｕｒａ３是否成功去除；??（６）將ｕｒａ３基因成功去除的菌株，連續(xù)在ＹＭ）培養(yǎng)基中傳３－５代，中?ｐＪＮ４４－ｃｒｅ。??，ｌａｎｋ１ｔｔｎ

分別用?ＥＲＧ５－ＵＰ－Ｆ／ＥＲＧ５－ＵＰ－Ｒ，ＥＲＧ５－Ｄ０ＷＮ－Ｆ／?ＥＲＧ５－ＤＯＷＮ－Ｒ?ＰＣＲ?擴(kuò)增??得到基因的上游序列７００ｂｐ，下游序列６７０ｂｐ�，F(xiàn)Ｇ５敲除質(zhì)粒的構(gòu)建流程??圖，如圖３－３，首先將上游片段連接到質(zhì)粒ｐＬｏｘｐ－ｕｒａ－ｌｏｘｐ上并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，??挑取單菌落接種于含有Ａｍｐ的ＬＢ液體培養(yǎng)基中，２４?ｈ后提取質(zhì)粒ｐＥＲＧ５－ｕｐ－??ｌｏｘｐ－ｕｒａ－ｌｏｘｐ。對(duì)質(zhì)粒酶切驗(yàn)證，使用Ａｐａｌ，Ｘｂａｌ酶切后分別得到７０２ｂｐ，５０３５ｂｐ??的兩個(gè)ＤＮＡ片段，如圖３＊４。在驗(yàn)證正確的陽性質(zhì)�；A(chǔ)上，連接下游片段，得??到質(zhì)粒?ｐＥＲＧ５－ｕｐ－ｌｏｘｐ－ｕｒａ－ｌｏｘｐ－ｄｏｗｎ，使用?Ｓｐｅｌ，?Ｎｄｅｌ?酶切后得到?６７７?ｂｐ，?５７０５??ｂｐ的兩個(gè)ＤＮＡ片段，如圖３＞４。至此，敲除質(zhì)粒的上下游均驗(yàn)證正確，即得到??敲除質(zhì)粒。??３８??
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2861980