目前,從高純蛋白質(zhì)到獲得適于結(jié)構(gòu)解析的蛋白質(zhì)晶體的成功率不到20%。因而,探求新的促進(jìn)蛋白質(zhì)形核的方法迫在眉睫。蛋白質(zhì)晶體形核的方式主要分為均質(zhì)形核法和異質(zhì)形核法。在亞穩(wěn)區(qū),蛋白質(zhì)通常不能通過(guò)均質(zhì)形核結(jié)晶,但可以利用修飾過(guò)的界面材料或固體顆粒作為形核劑可以誘導(dǎo)蛋白質(zhì)在亞穩(wěn)區(qū)形核,進(jìn)而獲得適于衍射的晶體。與形核劑類似,晶種在促進(jìn)蛋白質(zhì)結(jié)晶方面也發(fā)揮著重要作用,本文提出利用交聯(lián)晶體作為晶種誘導(dǎo)蛋白質(zhì)結(jié)晶。交聯(lián)蛋白質(zhì)晶體是利用交聯(lián)劑化學(xué)交聯(lián)的蛋白質(zhì)晶體,不溶于水和有機(jī)溶劑。交聯(lián)蛋白質(zhì)晶體具有優(yōu)越的機(jī)械、化學(xué)和熱穩(wěn)定性。此外,交聯(lián)蛋白質(zhì)晶體具有三維有序的結(jié)構(gòu),它們的衍射譜圖與自然生長(zhǎng)的晶體高度一致。綜上分析,交聯(lián)蛋白質(zhì)晶體可能是一種非常理想的誘導(dǎo)蛋白質(zhì)結(jié)晶的材料,本文初步探討了交聯(lián)籽晶在蛋白質(zhì)結(jié)晶中的效果。本文首先研究了高質(zhì)量交聯(lián)蛋白質(zhì)晶體的制備方法。天然生長(zhǎng)的蛋白質(zhì)晶體只能在結(jié)晶母液中保持完整的結(jié)構(gòu),一旦脫離母液會(huì)很快開裂并溶解。利用交聯(lián)劑對(duì)蛋白質(zhì)晶體進(jìn)行化學(xué)交聯(lián),可以有效地把蛋白質(zhì)分子限制在晶格內(nèi),從而解決晶體穩(wěn)定性的問(wèn)題。然而,利用交聯(lián)劑處理蛋白質(zhì)晶體通常面對(duì)一個(gè)問(wèn)題,即交聯(lián)會(huì)引起蛋白質(zhì)晶體開裂。為了解決這個(gè)問(wèn)題,本文通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)研究了多種因素(結(jié)晶生長(zhǎng)時(shí)間、溫度、交聯(lián)時(shí)間、溶液pH和戊二醛濃度)對(duì)交聯(lián)蛋白質(zhì)晶體開裂的影響,以獲得交聯(lián)蛋白質(zhì)晶體的最佳制備條件。目前,蛋白質(zhì)晶體與戊二醛之間的交聯(lián)交聯(lián)機(jī)理尚不清楚。晶體與戊二醛的交聯(lián)是一個(gè)自外而內(nèi)的過(guò)程,外部的蛋白質(zhì)分子優(yōu)先與戊二醛分子反應(yīng),隨后與內(nèi)部的蛋白質(zhì)分子交聯(lián),因而晶體內(nèi)外的交聯(lián)并不完全均勻。本論文選用不同的交聯(lián)時(shí)間(12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、84 h和108 h)分析了不同交聯(lián)程度的溶菌酶晶體質(zhì)量的差異。通過(guò)分析晶體的分辨率、鑲嵌度、B因子和晶格常數(shù)等,進(jìn)一步解釋戊二醛和蛋白質(zhì)晶體之間的交聯(lián)機(jī)理。在獲得高質(zhì)量交聯(lián)蛋白質(zhì)晶體后,便可以利用交聯(lián)晶體作為籽晶誘導(dǎo)目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)晶,主要開展了以下工作:(1)研究了交聯(lián)籽晶技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)晶可重復(fù)性的影響,發(fā)現(xiàn)交聯(lián)籽晶可以提高溶菌酶結(jié)晶的可重復(fù)性,并且蛋白質(zhì)濃度越低,提高幅度越明顯;(2)研究了交聯(lián)籽晶對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)晶條件篩選的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)交聯(lián)籽晶可以顯著提高蛋白質(zhì)的篩選成功率,并且交聯(lián)籽晶對(duì)同種蛋白質(zhì)的篩選效果最好;(3)研究了交聯(lián)籽晶對(duì)蛋白質(zhì)晶體質(zhì)量的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加交聯(lián)籽晶不僅可以顯著改善蛋白質(zhì)晶體的形貌,還可以提高蛋白質(zhì)晶體的質(zhì)量。綜上,本論文通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)研究了影響交聯(lián)蛋白質(zhì)晶體開裂的各種因素,提出了制備交聯(lián)溶菌酶晶體的最佳交聯(lián)條件。通過(guò)制備不同交聯(lián)時(shí)間的蛋白質(zhì)晶體,深入探索了戊二醛和蛋白質(zhì)晶體交聯(lián)的機(jī)理。最后,利用交聯(lián)蛋白質(zhì)晶體作為籽晶,開展了蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選和晶體質(zhì)量的研究,為制備高質(zhì)量的蛋白質(zhì)晶體提供一種新的方法。
【學(xué)位單位】：西北工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：O629.73
【部分圖文】：

圖 1-1 溶菌酶晶體在平行和垂直磁場(chǎng)下的定向。a-a’’代表 pH = 4.60，b-b’’代表 pH = 5.50，H 代表磁場(chǎng)強(qiáng)度。磁場(chǎng)強(qiáng)度為 10 T[25]Fig. 1-1 Clarification of the orientation responses of lysozyme crystals to the magnetic field using bothhorizontal and vertical magnetic fields. a-a’’represents pH 4.60; b-b’’representst pH 5.50; H: represents thdirection of magnetic field. The magnetic field was 10 T[25]

圖 1-2 交聯(lián)蛋白質(zhì)晶體制備示意圖[43]Fig. 1-2 A schematic illustration of the preparation process for CLPCs[43]第二步是蛋白質(zhì)晶體的化學(xué)交聯(lián)。常用的交聯(lián)劑可分為三類：同雙功能交聯(lián)劑功能交聯(lián)劑和光敏交聯(lián)劑。其中，同雙功能交聯(lián)劑有兩個(gè)相同的活化反應(yīng)基團(tuán)[44]

系統(tǒng)研究了交聯(lián)籽晶對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選和晶體質(zhì)量的影響。本論文的技術(shù)路線如圖1-3 所示。圖 1-3 本論文的實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線Fig. 1-3 The experimental route of the paper本論文的研究主要包括以下幾個(gè)方面：（1）戊二醛交聯(lián)溶菌酶晶體的工藝探討。設(shè)計(jì)了一個(gè)五因素（溫度、溶液 pH、晶體生長(zhǎng)時(shí)間、戊二醛濃度和交聯(lián)時(shí)間）四水平的正交實(shí)驗(yàn)以研究交聯(lián)溶菌酶晶體的開裂
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本文編號(hào)：2855702