發(fā)布時間：2020-10-25 08:27

　　 目前,從高純蛋白質(zhì)到獲得適于結(jié)構(gòu)解析的蛋白質(zhì)晶體的成功率不到20%。因而,探求新的促進蛋白質(zhì)形核的方法迫在眉睫。蛋白質(zhì)晶體形核的方式主要分為均質(zhì)形核法和異質(zhì)形核法。在亞穩(wěn)區(qū),蛋白質(zhì)通常不能通過均質(zhì)形核結(jié)晶,但可以利用修飾過的界面材料或固體顆粒作為形核劑可以誘導蛋白質(zhì)在亞穩(wěn)區(qū)形核,進而獲得適于衍射的晶體。與形核劑類似,晶種在促進蛋白質(zhì)結(jié)晶方面也發(fā)揮著重要作用,本文提出利用交聯(lián)晶體作為晶種誘導蛋白質(zhì)結(jié)晶。交聯(lián)蛋白質(zhì)晶體是利用交聯(lián)劑化學交聯(lián)的蛋白質(zhì)晶體,不溶于水和有機溶劑。交聯(lián)蛋白質(zhì)晶體具有優(yōu)越的機械、化學和熱穩(wěn)定性。此外,交聯(lián)蛋白質(zhì)晶體具有三維有序的結(jié)構(gòu),它們的衍射譜圖與自然生長的晶體高度一致。綜上分析,交聯(lián)蛋白質(zhì)晶體可能是一種非常理想的誘導蛋白質(zhì)結(jié)晶的材料,本文初步探討了交聯(lián)籽晶在蛋白質(zhì)結(jié)晶中的效果。本文首先研究了高質(zhì)量交聯(lián)蛋白質(zhì)晶體的制備方法。天然生長的蛋白質(zhì)晶體只能在結(jié)晶母液中保持完整的結(jié)構(gòu),一旦脫離母液會很快開裂并溶解。利用交聯(lián)劑對蛋白質(zhì)晶體進行化學交聯(lián),可以有效地把蛋白質(zhì)分子限制在晶格內(nèi),從而解決晶體穩(wěn)定性的問題。然而,利用交聯(lián)劑處理蛋白質(zhì)晶體通常面對一個問題,即交聯(lián)會引起蛋白質(zhì)晶體開裂。為了解決這個問題,本文通過正交實驗研究了多種因素(結(jié)晶生長時間、溫度、交聯(lián)時間、溶液pH和戊二醛濃度)對交聯(lián)蛋白質(zhì)晶體開裂的影響,以獲得交聯(lián)蛋白質(zhì)晶體的最佳制備條件。目前,蛋白質(zhì)晶體與戊二醛之間的交聯(lián)交聯(lián)機理尚不清楚。晶體與戊二醛的交聯(lián)是一個自外而內(nèi)的過程,外部的蛋白質(zhì)分子優(yōu)先與戊二醛分子反應,隨后與內(nèi)部的蛋白質(zhì)分子交聯(lián),因而晶體內(nèi)外的交聯(lián)并不完全均勻。本論文選用不同的交聯(lián)時間(12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、84 h和108 h)分析了不同交聯(lián)程度的溶菌酶晶體質(zhì)量的差異。通過分析晶體的分辨率、鑲嵌度、B因子和晶格常數(shù)等,進一步解釋戊二醛和蛋白質(zhì)晶體之間的交聯(lián)機理。在獲得高質(zhì)量交聯(lián)蛋白質(zhì)晶體后,便可以利用交聯(lián)晶體作為籽晶誘導目標蛋白質(zhì)結(jié)晶,主要開展了以下工作:(1)研究了交聯(lián)籽晶技術(shù)對蛋白質(zhì)結(jié)晶可重復性的影響,發(fā)現(xiàn)交聯(lián)籽晶可以提高溶菌酶結(jié)晶的可重復性,并且蛋白質(zhì)濃度越低,提高幅度越明顯;(2)研究了交聯(lián)籽晶對蛋白質(zhì)結(jié)晶條件篩選的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)交聯(lián)籽晶可以顯著提高蛋白質(zhì)的篩選成功率,并且交聯(lián)籽晶對同種蛋白質(zhì)的篩選效果最好;(3)研究了交聯(lián)籽晶對蛋白質(zhì)晶體質(zhì)量的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加交聯(lián)籽晶不僅可以顯著改善蛋白質(zhì)晶體的形貌,還可以提高蛋白質(zhì)晶體的質(zhì)量。綜上,本論文通過正交實驗系統(tǒng)研究了影響交聯(lián)蛋白質(zhì)晶體開裂的各種因素,提出了制備交聯(lián)溶菌酶晶體的最佳交聯(lián)條件。通過制備不同交聯(lián)時間的蛋白質(zhì)晶體,深入探索了戊二醛和蛋白質(zhì)晶體交聯(lián)的機理。最后,利用交聯(lián)蛋白質(zhì)晶體作為籽晶,開展了蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選和晶體質(zhì)量的研究,為制備高質(zhì)量的蛋白質(zhì)晶體提供一種新的方法。
【學位單位】：西北工業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：O629.73
【部分圖文】：

圖 1-1 溶菌酶晶體在平行和垂直磁場下的定向。a-a’’代表 pH = 4.60，b-b’’代表 pH = 5.50，H 代表磁場強度。磁場強度為 10 T[25]Fig. 1-1 Clarification of the orientation responses of lysozyme crystals to the magnetic field using bothhorizontal and vertical magnetic fields. a-a’’represents pH 4.60; b-b’’representst pH 5.50; H: represents thdirection of magnetic field. The magnetic field was 10 T[25]

圖 1-2 交聯(lián)蛋白質(zhì)晶體制備示意圖[43]Fig. 1-2 A schematic illustration of the preparation process for CLPCs[43]第二步是蛋白質(zhì)晶體的化學交聯(lián)。常用的交聯(lián)劑可分為三類：同雙功能交聯(lián)劑功能交聯(lián)劑和光敏交聯(lián)劑。其中，同雙功能交聯(lián)劑有兩個相同的活化反應基團[44]

系統(tǒng)研究了交聯(lián)籽晶對蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選和晶體質(zhì)量的影響。本論文的技術(shù)路線如圖1-3 所示。圖 1-3 本論文的實驗技術(shù)路線Fig. 1-3 The experimental route of the paper本論文的研究主要包括以下幾個方面：（1）戊二醛交聯(lián)溶菌酶晶體的工藝探討。設(shè)計了一個五因素（溫度、溶液 pH、晶體生長時間、戊二醛濃度和交聯(lián)時間）四水平的正交實驗以研究交聯(lián)溶菌酶晶體的開裂
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本文編號：2855702