O-甲基化反應(yīng)被運(yùn)用于化合物的甲基化修飾、芳香醚的生產(chǎn)與羧基基團(tuán)的保護(hù)等,在化合物的合成中具有廣泛的應(yīng)用。由于化工生產(chǎn)中使用的傳統(tǒng)甲基化試劑存在高毒性、低選擇性等不足,需要開(kāi)發(fā)綠色溫和的替代型生產(chǎn)工藝。O--甲基轉(zhuǎn)移酶作為特異性催化O-甲基化反應(yīng)的生物催化劑,具有反應(yīng)條件溫和、選擇性高等優(yōu)點(diǎn),在化工生產(chǎn)中有著巨大的應(yīng)用潛力。除此之外,O-甲基轉(zhuǎn)移酶還是褪黑素、輔酶Q10等天然產(chǎn)物生物合成途徑中的限速酶,其活性制約了目標(biāo)產(chǎn)物生物合成效率。因此,對(duì)O-甲基轉(zhuǎn)移酶的研究具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。本文通過(guò)基因挖掘構(gòu)建O-甲基轉(zhuǎn)移酶庫(kù),結(jié)合多底物篩選的方法,獲得了具有廣底物譜的O-甲基轉(zhuǎn)移酶AtCOMT(Arabidopsis thaliana Caffeic acid O-methyltransferase);并通過(guò)理性設(shè)計(jì)對(duì) AtCOMT進(jìn)行了 分子改造,提高了其催化褪黑素生物合成途徑限速步驟(N-乙酰-5-羥色胺O-甲基化生成褪黑素)的活性,并在此基礎(chǔ)上通過(guò)酶催化動(dòng)力學(xué)分析與分子動(dòng)力學(xué)模擬對(duì)活性提高的機(jī)理進(jìn)行了探討。本文具體實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和結(jié)果如下:(1)通過(guò)基因挖掘的方法篩選出不同來(lái)源與功能的O-甲基轉(zhuǎn)移酶,通過(guò)分子克隆技術(shù)在大腸桿菌中進(jìn)行異源表達(dá),成功克隆了 16個(gè)O-甲基轉(zhuǎn)移酶,建立了 O-甲基轉(zhuǎn)移酶庫(kù);(2)針對(duì)多個(gè)具有研究?jī)r(jià)值且底物易得的O-甲基化反應(yīng),建立了相應(yīng)的檢測(cè)方法(HPLC、GC),用于篩選合適的O-甲基轉(zhuǎn)移酶。通過(guò)多底物的篩選,最終從O-甲基轉(zhuǎn)移庫(kù)中獲得具有廣底物譜的AtCOMT;(3)鑒于AtCOMT能夠催化N-乙酰-5-羥色胺(NAS)的O-甲基化反應(yīng),而此反應(yīng)已被明確報(bào)道為褪黑素異源生物合成途徑中的關(guān)鍵限速步驟,以NAS為底物對(duì)AtCOMT進(jìn)行了理性改造。通過(guò)對(duì)AtCOMT進(jìn)行同源建模,結(jié)合分子對(duì)接獲得酶-底物復(fù)合物的構(gòu)象,并據(jù)此制定理性設(shè)計(jì)策略,增強(qiáng)酶的活性口袋對(duì)底物NAS的結(jié)合能力,最終獲得三點(diǎn)組合突變體 C296F-Q310L-V314T,活性提高 8.5 倍;(4)通過(guò)對(duì)野生型AtCOMT與優(yōu)勢(shì)突變體的酶催化動(dòng)力學(xué)分析和分子動(dòng)力學(xué)模擬,發(fā)現(xiàn)突變體對(duì)NAS的親和性與催化效率都有所提高;296位和310位突變氨基酸與NAS之間的作用力增強(qiáng);314位突變氨基酸與前兩個(gè)點(diǎn)突變存在協(xié)同作用,并影響了局部的蛋白結(jié)構(gòu),促進(jìn)了 310位突變氨基酸與底物之間的結(jié)合。綜合得出突變體通過(guò)增強(qiáng)與NAS的結(jié)合作用從而提高酶活性的結(jié)論。
【學(xué)位單位】：北京化工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：O629.8
【部分圖文】：

圖１－１邋ｏ－甲基化反應(yīng)逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｏ－ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ邋ｒｅａｃｔｉｏｎ逡逑為鄰苯二酚經(jīng)過(guò)Ｏ－甲基化生成愈創(chuàng)木酚；Ｂ為水楊酸經(jīng)過(guò)Ｏ－甲基化生成水楊酸甲酯；Ｃ經(jīng)過(guò)０－甲基化生成克拉霉素。逡逑酶促０－甲基化反應(yīng)逡逑０－甲基化同樣廣泛存在于生物體中，而在生物體內(nèi)進(jìn)行的０－甲基化與工業(yè)中不同；生物體中的０－甲基化反應(yīng)是在酶的催化作用下，通過(guò)活性的甲基供體來(lái)，具有反應(yīng)條件溫和、高效與選擇性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。酶促０－甲基化反應(yīng)，在生物體調(diào)整修飾基因與蛋白質(zhì)的作用，并參與到物質(zhì)合成中．？在原核生物中蛋白質(zhì)基化能夠影響細(xì)菌的趨化性信號(hào)的傳導(dǎo)和抗原表位的變化愈創(chuàng)木基木質(zhì)組成植物木質(zhì)素的單體之一，其合成過(guò)程中Ｃ３位置需經(jīng)過(guò)０－甲基化反應(yīng)［２｜，２２］與其他兩種單體聚合形成木質(zhì)素，而后者幫助植物抵御外力破壞、病害與細(xì)胞亂等脅迫［２２］。逡逑

修飾以及植物類(lèi)黃酮的合成等等。兒茶酚胺0－甲基轉(zhuǎn)移酶（Ｃａｔｅｃｈｏｌ－０－ｍｅｔｈｙｈｍｎｓｆｅｒ逡逑ａｓｅ）存在于人的體內(nèi)，起到代謝兒茶酚類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)的作用；其功能是在鎂離子的輔助逡逑下，以ＳＡＭ為提供活性甲基的輔酶，０－甲基化兒茶酚胺苯環(huán)的Ｃ３位的羥基（圖１－２），逡逑而經(jīng)過(guò)０－甲基化修飾的多巴胺則會(huì)進(jìn)一步在體內(nèi)分解失活；由于多巴胺與精神活動(dòng)及逡逑軀體運(yùn)動(dòng)相關(guān)，因此兒茶酚胺？－甲基轉(zhuǎn)移酶對(duì)帕金森癥、精神分裂癥等神經(jīng)疾病和運(yùn)逡逑動(dòng)障礙性疾病具有研宄意義［２４＿２８］。類(lèi)黃酮0－甲基轉(zhuǎn)移酶（Ｆｌａｖｏｎｏｉｄ邋Ｏ－ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒ逡逑ａｓｅ）在生物體內(nèi)起到對(duì)類(lèi)黃酮物質(zhì)進(jìn)行０－甲基化修飾的作用；類(lèi)黃酮的羥基自由基逡逑經(jīng)過(guò)Ｏ－甲基化修飾后數(shù)量減少，由此弱化了葡萄苷酸化作用與硫酸鹽的接收，從而增逡逑強(qiáng)了親脂性與代謝穩(wěn)定性［２９－３１１。咖啡酰輔酶Ａ氧甲基轉(zhuǎn)移酶（Ｃａｆｆｅｏｙｌ－ＣｏＡ邋３－０－ｍｅｔ逡逑ｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｍｓｅ）是植物體內(nèi)木質(zhì)素合成過(guò)程中所需的關(guān)鍵酶，可催化咖啡酰輔酶Ａ（Ｃａ逡逑ｆｆｅｏｙｌ－ＣｏＡ）生成阿魏酰輔酶Ａ（Ｆｅｒｕｌｏｙｌ－ＣｏＡ），主要參與愈創(chuàng)木基木質(zhì)素的合成，并逡逑且與紫丁香基木質(zhì)素的合成有關(guān)，是研究調(diào)控植物木質(zhì)素合成的關(guān)鍵酶［２２】。逡逑、’邐］兒茶賺氧位甲基轉(zhuǎn)移酶邐ｊ逡逑ｎｈ２邐ＮＨ２逡逑ＨＯ邐ＳＡＭ邋ＳＡＨ邐ＨＯ’逡逑圖丨－２兒茶酚胺０－甲基轉(zhuǎn)移酶催化反應(yīng)逡逑Ｆｉｇ．邋１－２邋Ｃａｔｅｃｈｏｌ－Ｏ－ｍｅｔｈｙｈｒａｎｓｆｅｒａｓｅ邋ｃａｔａｌｙｔｉｃ邋ｒｅａｃｔｉｏｎ逡逑0－甲基轉(zhuǎn)移酶在生物合成途徑中廣泛存在

ｒｏ，ｊ0邋＋邋ＸＸｊ逡逑Ｈ邐Ｕ逡逑圖１＿５褪黑素化學(xué)合成途徑逡逑Ｆｉｇ．邋１－５邋Ｍｅｌａｔｏｎｉｎ邋ｃｈｅｍｉｃａｌ邋ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ邋ｐａｔｈｗａｙ逡逑注：Ａ為丙二酸二乙酯和丙烯腈為原料的合成途徑；Ｂ為１

【參考文獻(xiàn)】

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1 萬(wàn)艷娟;吳軍林;吳清平;;輔酶Q_(10)生理功能及應(yīng)用研究進(jìn)展[J];食品工業(yè)科技;2014年14期

2 王華美;于延沖;付春祥;周功克;高歡歡;;木質(zhì)素合成關(guān)鍵酶咖啡酰輔酶A氧甲基轉(zhuǎn)移酶的研究進(jìn)展[J];基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué);2014年02期

3 陳單丹;岑沛霖;劉文;徐志南;;大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)免疫抑制劑他克莫司的生物合成機(jī)制研究進(jìn)展[J];有機(jī)化學(xué);2013年06期

4 鄭立穩(wěn);高永超;張強(qiáng);邱維忠;王加寧;遲建國(guó);;香蘭素的化學(xué)合成方法研究[J];化工時(shí)刊;2012年06期

5 張傳麗;仲月明;沈丹紅;陳鵬;;植物類(lèi)黃酮O-甲基轉(zhuǎn)移酶研究進(jìn)展[J];西北植物學(xué)報(bào);2012年06期

6 王雪;梁建友;李瑞;;水楊酸甲酯生產(chǎn)工藝的研究進(jìn)展[J];化工時(shí)刊;2009年04期

7 舒婷;李光興;;碳酸二甲酯作甲基化試劑的研究進(jìn)展[J];化工中間體;2008年01期

8 田鈴;嵇保中;劉曙雯;金鳳;高潔;;甲基轉(zhuǎn)移酶的功能與分類(lèi)[J];生命的化學(xué);2007年05期

9 李付鸞;謝忠平;;兒茶酚胺氧位甲基轉(zhuǎn)移酶的克隆表達(dá)及純化[J];中國(guó)生化藥物雜志;2007年01期

10 孔憲明;宮紅;姜恒;李秀琴;張溪波;;2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮的合成及工業(yè)放大試驗(yàn)[J];精細(xì)化工;2006年07期

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1 陳冰;趙寧;魏偉;孫予罕;;高效合成鄰羥基苯甲醚綠色新途徑[A];第七屆全國(guó)催化劑制備科學(xué)與技術(shù)研討會(huì)論文集[C];2009年

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1 郭斐;利用半理性和理性策略對(duì)酶活性及手性選擇性的設(shè)計(jì)[D];浙江大學(xué);2015年

2 朱玉威;氧—甲基轉(zhuǎn)移酶Ubig和蓖麻毒素A鏈與抗體6C2復(fù)合物的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究[D];中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué);2014年

3 馬成英;茶樹(shù)O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因克隆及其對(duì)類(lèi)黃酮催化特異性的研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2013年

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3 劉德福;新型�；图谆磻�(yīng)探索[D];蘇州大學(xué);2015年

4 王寧;碳酸二甲酯的綠色工藝開(kāi)發(fā)[D];青島科技大學(xué);2012年

5 蔡安安;褪黑素的綠色合成方法研究[D];長(zhǎng)沙理工大學(xué);2011年

本文編號(hào)：2830527