發(fā)布時間：2020-09-30 01:09

　　 O-甲基化反應被運用于化合物的甲基化修飾、芳香醚的生產(chǎn)與羧基基團的保護等,在化合物的合成中具有廣泛的應用。由于化工生產(chǎn)中使用的傳統(tǒng)甲基化試劑存在高毒性、低選擇性等不足,需要開發(fā)綠色溫和的替代型生產(chǎn)工藝。O--甲基轉移酶作為特異性催化O-甲基化反應的生物催化劑,具有反應條件溫和、選擇性高等優(yōu)點,在化工生產(chǎn)中有著巨大的應用潛力。除此之外,O-甲基轉移酶還是褪黑素、輔酶Q10等天然產(chǎn)物生物合成途徑中的限速酶,其活性制約了目標產(chǎn)物生物合成效率。因此,對O-甲基轉移酶的研究具有重要的理論意義和應用價值。本文通過基因挖掘構建O-甲基轉移酶庫,結合多底物篩選的方法,獲得了具有廣底物譜的O-甲基轉移酶AtCOMT(Arabidopsis thaliana Caffeic acid O-methyltransferase);并通過理性設計對 AtCOMT進行了 分子改造,提高了其催化褪黑素生物合成途徑限速步驟(N-乙酰-5-羥色胺O-甲基化生成褪黑素)的活性,并在此基礎上通過酶催化動力學分析與分子動力學模擬對活性提高的機理進行了探討。本文具體實驗內(nèi)容和結果如下:(1)通過基因挖掘的方法篩選出不同來源與功能的O-甲基轉移酶,通過分子克隆技術在大腸桿菌中進行異源表達,成功克隆了 16個O-甲基轉移酶,建立了 O-甲基轉移酶庫;(2)針對多個具有研究價值且底物易得的O-甲基化反應,建立了相應的檢測方法(HPLC、GC),用于篩選合適的O-甲基轉移酶。通過多底物的篩選,最終從O-甲基轉移庫中獲得具有廣底物譜的AtCOMT;(3)鑒于AtCOMT能夠催化N-乙酰-5-羥色胺(NAS)的O-甲基化反應,而此反應已被明確報道為褪黑素異源生物合成途徑中的關鍵限速步驟,以NAS為底物對AtCOMT進行了理性改造。通過對AtCOMT進行同源建模,結合分子對接獲得酶-底物復合物的構象,并據(jù)此制定理性設計策略,增強酶的活性口袋對底物NAS的結合能力,最終獲得三點組合突變體 C296F-Q310L-V314T,活性提高 8.5 倍;(4)通過對野生型AtCOMT與優(yōu)勢突變體的酶催化動力學分析和分子動力學模擬,發(fā)現(xiàn)突變體對NAS的親和性與催化效率都有所提高;296位和310位突變氨基酸與NAS之間的作用力增強;314位突變氨基酸與前兩個點突變存在協(xié)同作用,并影響了局部的蛋白結構,促進了 310位突變氨基酸與底物之間的結合。綜合得出突變體通過增強與NAS的結合作用從而提高酶活性的結論。
【學位單位】：北京化工大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：O629.8
【部分圖文】：

圖１－１邋ｏ－甲基化反應逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｏ－ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ邋ｒｅａｃｔｉｏｎ逡逑為鄰苯二酚經(jīng)過Ｏ－甲基化生成愈創(chuàng)木酚；Ｂ為水楊酸經(jīng)過Ｏ－甲基化生成水楊酸甲酯；Ｃ經(jīng)過０－甲基化生成克拉霉素。逡逑酶促０－甲基化反應逡逑０－甲基化同樣廣泛存在于生物體中，而在生物體內(nèi)進行的０－甲基化與工業(yè)中不同；生物體中的０－甲基化反應是在酶的催化作用下，通過活性的甲基供體來，具有反應條件溫和、高效與選擇性強等優(yōu)點。酶促０－甲基化反應，在生物體調(diào)整修飾基因與蛋白質的作用，并參與到物質合成中．？在原核生物中蛋白質基化能夠影響細菌的趨化性信號的傳導和抗原表位的變化愈創(chuàng)木基木質組成植物木質素的單體之一，其合成過程中Ｃ３位置需經(jīng)過０－甲基化反應［２｜，２２］與其他兩種單體聚合形成木質素，而后者幫助植物抵御外力破壞、病害與細胞亂等脅迫［２２］。逡逑

修飾以及植物類黃酮的合成等等。兒茶酚胺0－甲基轉移酶（Ｃａｔｅｃｈｏｌ－０－ｍｅｔｈｙｈｍｎｓｆｅｒ逡逑ａｓｅ）存在于人的體內(nèi)，起到代謝兒茶酚類神經(jīng)遞質的作用；其功能是在鎂離子的輔助逡逑下，以ＳＡＭ為提供活性甲基的輔酶，０－甲基化兒茶酚胺苯環(huán)的Ｃ３位的羥基（圖１－２），逡逑而經(jīng)過０－甲基化修飾的多巴胺則會進一步在體內(nèi)分解失活；由于多巴胺與精神活動及逡逑軀體運動相關，因此兒茶酚胺？－甲基轉移酶對帕金森癥、精神分裂癥等神經(jīng)疾病和運逡逑動障礙性疾病具有研宄意義［２４＿２８］。類黃酮0－甲基轉移酶（Ｆｌａｖｏｎｏｉｄ邋Ｏ－ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒ逡逑ａｓｅ）在生物體內(nèi)起到對類黃酮物質進行０－甲基化修飾的作用；類黃酮的羥基自由基逡逑經(jīng)過Ｏ－甲基化修飾后數(shù)量減少，由此弱化了葡萄苷酸化作用與硫酸鹽的接收，從而增逡逑強了親脂性與代謝穩(wěn)定性［２９－３１１�？Х弱］o酶Ａ氧甲基轉移酶（Ｃａｆｆｅｏｙｌ－ＣｏＡ邋３－０－ｍｅｔ逡逑ｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｍｓｅ）是植物體內(nèi)木質素合成過程中所需的關鍵酶，可催化咖啡酰輔酶Ａ（Ｃａ逡逑ｆｆｅｏｙｌ－ＣｏＡ）生成阿魏酰輔酶Ａ（Ｆｅｒｕｌｏｙｌ－ＣｏＡ），主要參與愈創(chuàng)木基木質素的合成，并逡逑且與紫丁香基木質素的合成有關，是研究調(diào)控植物木質素合成的關鍵酶［２２】。逡逑、’邐］兒茶賺氧位甲基轉移酶邐ｊ逡逑ｎｈ２邐ＮＨ２逡逑ＨＯ邐ＳＡＭ邋ＳＡＨ邐ＨＯ’逡逑圖丨－２兒茶酚胺０－甲基轉移酶催化反應逡逑Ｆｉｇ．邋１－２邋Ｃａｔｅｃｈｏｌ－Ｏ－ｍｅｔｈｙｈｒａｎｓｆｅｒａｓｅ邋ｃａｔａｌｙｔｉｃ邋ｒｅａｃｔｉｏｎ逡逑0－甲基轉移酶在生物合成途徑中廣泛存在

ｒｏ，ｊ0邋＋邋ＸＸｊ逡逑Ｈ邐Ｕ逡逑圖１＿５褪黑素化學合成途徑逡逑Ｆｉｇ．邋１－５邋Ｍｅｌａｔｏｎｉｎ邋ｃｈｅｍｉｃａｌ邋ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ邋ｐａｔｈｗａｙ逡逑注：Ａ為丙二酸二乙酯和丙烯腈為原料的合成途徑；Ｂ為１

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本文編號：2830527