ε-聚賴氨酸(ε-PL)作為目前自然界當(dāng)中已知的兩種氨基酸同聚物其中之一,其由L-賴氨酸單體之間通過(guò)α-羧基與ε-氨基縮合形成。由于ε-聚賴氨酸具有廣譜的抑菌性、良好的水溶性和熱穩(wěn)定性以及很好的生物安全性。因此,ε-聚賴氨酸在一些國(guó)家被批準(zhǔn)作為天然生物防腐劑使用。除了作為防腐劑使用以外,ε-聚賴氨酸還有很多方面的應(yīng)用,諸如作為藥物載體、食療劑、生物材料等等。隨著ε-聚賴氨酸應(yīng)用的越來(lái)越廣泛,對(duì)ε-聚賴氨酸的需求也越來(lái)越大。因此,構(gòu)建ε-聚賴氨酸高效表達(dá)載體的研究具有非常高的實(shí)際意義與應(yīng)用價(jià)值。本研究以在卡特利鏈霉菌S.cattleya DSM 46488中發(fā)現(xiàn)的一對(duì)有功能的II型毒素-抗毒素系統(tǒng)relBE2sca搭建一套在無(wú)抗生素選擇壓力條件下ε-聚賴氨酸合成酶穩(wěn)定表達(dá)的新型鏈霉菌表達(dá)系統(tǒng),以替代傳統(tǒng)的抗生素篩選標(biāo)記的鏈霉菌表達(dá)系統(tǒng)。本研究在S.diastatochromogenes CGMCC3145 pls缺失突變株中,將毒素基因relE2sca整合至突變株的染色體,抗毒素基因relB2sca與S.diastatochromogenes CGMCC3145 pls基因一起克隆至表達(dá)載體,構(gòu)建了無(wú)抗生素選擇壓力條件下ε-聚賴氨酸合成酶穩(wěn)定表達(dá)的新型鏈霉菌表達(dá)系統(tǒng)。同時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明這套TA系統(tǒng)確實(shí)能夠延緩ε-聚賴氨酸合成酶表達(dá)質(zhì)粒的丟失。鑒于S.cattleya DSM 46488遺傳操作的困難以及目前報(bào)道的短鏈ε-聚賴氨酸產(chǎn)生菌較低的發(fā)酵水平,本研究篩選了常用的高效鏈霉菌表達(dá)宿主,以期找到能進(jìn)行ε-聚賴氨酸合成酶異源表達(dá)的高效宿主,并在其中構(gòu)建ε-聚賴氨酸穩(wěn)定表達(dá)的新型鏈霉菌表達(dá)系統(tǒng)。這樣我們就能構(gòu)建一個(gè)高效穩(wěn)定的短鏈ε-聚賴氨酸工程菌。但是實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明無(wú)論是長(zhǎng)鏈ε-聚賴氨酸產(chǎn)生菌的pls基因還是短鏈ε-聚賴氨酸產(chǎn)生菌的pls基因都無(wú)法在我們選定的異源表達(dá)宿主中表達(dá)。為了探究pls基因在異源表達(dá)宿主為什么不能表達(dá),我們對(duì)S.cattleya DSM46488 pls基因雙缺失突變株進(jìn)行了自身pls基因回補(bǔ)以及S.diastatochromogenes CGMCC3145 pls基因的異源表達(dá),我們發(fā)現(xiàn)回補(bǔ)了自身質(zhì)粒pls基因的突變株恢復(fù)了短鏈ε-聚賴氨酸的產(chǎn)生能力但是產(chǎn)量遠(yuǎn)低于野生型,而長(zhǎng)鏈ε-聚賴氨酸產(chǎn)生菌pls基因不能在S.cattleya DSM 46488 pls基因雙缺失突變株中表達(dá),這說(shuō)明可能除了pls基因,ε-聚賴氨酸的合成還需要其他因素的協(xié)助,這也可能是在常用的鏈霉菌表達(dá)宿主中異源表達(dá)失敗的原因。本研究以淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌S.diastatochromogenes CGMCC3145和卡特利鏈霉菌S.cattleya DSM 46488為主要研究目標(biāo),成功利用毒素-抗毒素系統(tǒng)relBE2sca搭建一套在無(wú)抗生素選擇壓力條件下ε-聚賴氨酸合成酶穩(wěn)定表達(dá)的新型鏈霉菌表達(dá)系統(tǒng)。為基于relBE2sca構(gòu)建食品安全級(jí)的鏈霉菌表達(dá)系統(tǒng)以及高效便捷的無(wú)抗生素選擇壓力鏈霉菌表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建提供了思路。同時(shí)通過(guò)基因的敲除和回補(bǔ),探究pls基因是否為控制ε-聚賴氨酸合成的唯一關(guān)鍵因素,為接下來(lái)進(jìn)一步研究ε-聚賴氨酸合成機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：O631;Q78
【部分圖文】：

.1 ε-PL 的結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)ε-聚賴氨酸是一種天然氨基酸同聚物，它與 γ-聚谷氨酸是目前為止自然界有的兩種天然氨基酸同聚物[1]，ε-聚賴氨酸是 1977 年日本科學(xué)家在篩選放對(duì) Dragendorff 呈陽(yáng)性反應(yīng)的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)的[2-4]。ε-聚賴氨酸通常是由 25 L-賴氨酸殘基通過(guò) α-羧基和 ε-氨基脫水縮合形成酰胺鍵連接而成（圖 1-子量通常為 2.5~4.5kDa[5]。ε-聚賴氨酸純品為白色或淡黃色粉末，具有強(qiáng)烈濕性，當(dāng)分子量較大時(shí)有輕微的苦味，其具有良好的水溶性，除了微溶于乙外，不溶于有機(jī)溶劑（比如乙酸乙酯和乙醚等等）[6]。ε-聚賴氨酸是混合物包含多個(gè)聚合度，它的熔點(diǎn)并不固定，當(dāng)加熱到 250℃開(kāi)始融化[7]。除此之賴氨酸還具有非常好的熱穩(wěn)定性，即使在 120℃加熱 20 分鐘，它仍然能保高的活性[8]。

圖 1-3 TA 系統(tǒng)在 DNA 克隆方面的應(yīng)用[44]Figure 1-3 Application of TA systems in DNA cloningA) 目標(biāo)基因插入破壞毒素基因使得細(xì)胞存活。 B) 穩(wěn)定克隆系統(tǒng)的原理。 C)網(wǎng)關(guān)克隆系統(tǒng)的篩選原理。II 型 TA 系統(tǒng)除了被應(yīng)用于 DNA 克隆之外，Sevillano L 等利用 yefM/yoeB統(tǒng)在變鉛青鏈霉菌中構(gòu)建了一套穩(wěn)定的表達(dá)系統(tǒng)[45]。他們首先敲除變鉛青菌染色體上 yefMsl/yoeBsl 基因；其次，在溫敏型質(zhì)粒連上抗毒素基因，再轉(zhuǎn)移至變鉛青鏈霉菌宿主中；最后，將毒素基因整合到宿主基因組中。將表粒接上抗毒素基因結(jié)合轉(zhuǎn)移至變鉛青鏈霉菌宿主，再通過(guò)改變溫度消除溫敏粒，表達(dá)目標(biāo)產(chǎn)物的體系即構(gòu)建完成（如圖 1-4）。

圖 1-4 基于 TA 系統(tǒng)的穩(wěn)定表達(dá)體系構(gòu)建[45]Figure 1-4 Construction of stable expression system based on TA system.敲除毒素-抗毒素系統(tǒng)。2.導(dǎo)入包含抗毒素的溫敏型質(zhì)粒 3.整合毒素基因至染色體 4.導(dǎo)入有抗毒素基因和目標(biāo)基因的表達(dá)載體，消除溫敏型質(zhì)粒。沒(méi)有導(dǎo)入表達(dá)載體的將會(huì)被毒殺死。在微生物發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中，質(zhì)粒的不穩(wěn)定性是一個(gè)非常嚴(yán)重的問(wèn)題。為了質(zhì)粒的丟失，通常是在目標(biāo)質(zhì)粒上帶上抗性基因，然后在培養(yǎng)基中加入一定的抗生素。但是這樣做又會(huì)帶來(lái)一些新的問(wèn)題，比如生產(chǎn)成本的增加，增加純化目標(biāo)產(chǎn)物的難度，同時(shí)抗生素的大量使用所造成的環(huán)境污染問(wèn)題。這些使得 TA 系統(tǒng)作為替代抗性標(biāo)記的新型篩選標(biāo)記的開(kāi)發(fā)勢(shì)在必行。.4 本文的立題依據(jù)及研究?jī)?nèi)容

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 楚海榮;付玉榮;伊正君;;細(xì)菌毒素-抗毒素系統(tǒng)研究進(jìn)展[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2015年02期

2 耿偉濤;宋存江;解慧;馮俊;謝晨庚;王淑芳;;微生物合成ε-聚賴氨酸的研究進(jìn)展[J];食品與發(fā)酵工業(yè);2012年04期

3 賈士儒;許春英;譚之磊;曹偉鋒;歐z延

本文編號(hào)：2827555