石油等化石資源可以用作燃料,同時(shí)也用作許多化工產(chǎn)品的原料。但是隨著石油資源的消耗與隨之而來的環(huán)境問題,尋找石油的替代品成為了一個(gè)熱門的研究方向。合成生物學(xué)通過構(gòu)建工程菌利用廉價(jià)的甘油等碳源實(shí)現(xiàn)化學(xué)品的生物合成,成為了一種新的生產(chǎn)化學(xué)品的方式。不飽和烯酸是一類重要的化學(xué)品,香豆酸、肉桂酸和粘糠酸是其中具有重要價(jià)值的組成部分。香豆酸和肉桂酸經(jīng)過加氫還原得到的兩種產(chǎn)物對羥基苯丙酸和苯丙酸也是重要的香料和藥物前體。但是目前并沒有生物合成這兩種產(chǎn)物的報(bào)道。己二酸作為一種二元羧酸是生產(chǎn)尼龍的重要原料,目前工業(yè)上通過粘糠酸加氫生成己二酸。香豆酸、肉桂酸以及粘糠酸都具有α-β碳碳雙鍵,為了獲得這幾種化學(xué)品加氫后的飽和有機(jī)酸,實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟為篩選能夠還原α-β碳碳雙鍵的還原酶。烯醇還原酶可以對許多不飽和底物進(jìn)行加氫還原,因此實(shí)驗(yàn)對多種不同來源的烯醇還原酶進(jìn)行研究,通過體內(nèi)酶活測試確定了來自丙酮丁醇梭菌的烯醇還原酶(CaER)能夠完成香豆酸和肉桂酸的加氫還原。在有氧條件下,CaER對于香豆酸的初始酶活速度可以達(dá)到1.26 mmol/h/gDCW;對于肉桂酸的初始酶活速度可以達(dá)到3.18mmol/h/gDCW。確定了關(guān)鍵酶以后,通過添加實(shí)驗(yàn)對酪氨酸到對羥基苯丙酸、苯丙氨酸到苯丙酸的代謝途徑進(jìn)行了模塊優(yōu)化。將該烯醇還原酶與香豆酸、肉桂酸的合成途徑結(jié)合起來,實(shí)現(xiàn)了對羥基苯丙酸和苯丙酸在大腸桿菌中的組成生物學(xué)合成。工程菌在72 h分別合成了225.10 mg/L對羥基苯丙酸和356.43 mg/L苯丙酸。CaER催化香豆酸和肉桂酸的體內(nèi)加氫反應(yīng)填補(bǔ)了生物合成對羥基苯丙酸和苯丙酸的空白。為了進(jìn)一步利用烯醇還原酶實(shí)現(xiàn)產(chǎn)量的提升,以苯丙酸作為目標(biāo)產(chǎn)物對CaER的表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化研究。CaER的催化反應(yīng)需要NADH作為輔因子,為了使被氧化的NAD+重新還原成為NADH,甲酸脫氫酶被引入培養(yǎng)體系中。在輔酶再生系統(tǒng)存在下,苯丙酸的產(chǎn)量提高到394.74 mg/L。苯丙酸合成途徑是需氧途徑和厭氧途徑的結(jié)合,為了平衡途徑中各個(gè)模塊的不同氧氣需求,實(shí)驗(yàn)比較不同轉(zhuǎn)速下的產(chǎn)量,確定200 rpm下苯丙酸的產(chǎn)量達(dá)到403.30 mg/L。采用共培養(yǎng)體系并引入可以促進(jìn)細(xì)胞在低氧狀態(tài)下對氧的吸收的血紅蛋白,促進(jìn)了苯丙酸產(chǎn)量的增加使苯丙酸的產(chǎn)量達(dá)到了507.16 mg/L。啟動(dòng)子的強(qiáng)弱對CaER的表達(dá)也有影響,將中強(qiáng)度tac啟動(dòng)子和高強(qiáng)度T7啟動(dòng)子與lac啟動(dòng)子進(jìn)行比較,結(jié)果顯示tac啟動(dòng)子調(diào)控下苯丙酸的產(chǎn)量達(dá)到了467.98 mg/L。實(shí)驗(yàn)證明CaER可以作用于香豆酸與肉桂酸,因此為了測試CaER對粘糠酸的催化能力,體內(nèi)酶活測試選用了有氧和微好氧兩種條件。在有氧條件下,添加粘糠酸并未檢測到己二酸的生成。當(dāng)培養(yǎng)條件改變?yōu)槲⒑醚鯒l件后,24 h可以檢測到74.23 mg/L己二酸的生成。為了測試從水楊酸生產(chǎn)粘糠酸的反應(yīng)效率,添加水楊酸進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示生成了28.70 mg/L己二酸。整合整條途徑后實(shí)現(xiàn)了經(jīng)由粘糠酸的己二酸的生物合成,獲得了12.42 mg/L己二酸。共培養(yǎng)體系也用于增進(jìn)己二酸的產(chǎn)量,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明共培養(yǎng)體系中積累了 18.29 mg/L己二酸。當(dāng)進(jìn)一步引入VHB后,共培養(yǎng)體系內(nèi)積累了28.22 mg/L己二酸。本研究首次實(shí)現(xiàn)了對羥基苯丙酸與苯丙酸的組合生物學(xué)合成,并且建立了一條新的由CaER調(diào)控的己二酸合成途徑,展示了合成生物學(xué)廣泛適用的設(shè)計(jì)策略。
【學(xué)位單位】：北京化工大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：O622.5
【部分圖文】：

但是化石燃料為不可再生資源，化學(xué)合成會(huì)導(dǎo)致環(huán)境污染如近些年來的霧逡逑霾，合成過程中也釋放出大量的溫室氣體Ｎ２Ｏ［１００］。而生物法避免了這些弊端，對環(huán)逡逑境友好，具有可再生性和環(huán)境兼容性。目前己二酸的化學(xué)合成途徑如圖１－５所示，己逡逑二酸的半生物合成途徑（基于粘糠酸和葡萄糖二酸）如圖１－６所示。逡逑Ａ邋＾邋８逡逑ｂｅｎｚｅｎｅ邐ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ逡逑~枴危遙錚錚礤澹簦澹恚穡澹潁幔簦酰潁邋澹�？邋Ｕ０欏e椋紓瑁簦澹保�？ｍ辶x鮮垮危潁觶希儒義希希殄澹悖悖歟錚瑁澹幔睿錚戾義希殄危危義希福常埃梗

本文編號：2822196