本文關(guān)鍵詞：G-四鏈體DNA酶催化魯米諾化學(xué)發(fā)光在鉀離子、鉛離子分析中的應(yīng)用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：以化學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)的化學(xué)發(fā)光分析法因具有無背景散射光干擾、靈敏度高、分析速度快、線性范圍寬,同時(shí)儀器設(shè)備簡(jiǎn)單、廉價(jià)、易微型化等獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)在無機(jī)物、有機(jī)物的痕量和超痕量分析領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。其中魯米諾發(fā)光體因具有較高的發(fā)光量子產(chǎn)率和較好的水溶性,是目前研究及應(yīng)用最為廣泛的一類化學(xué)發(fā)光試劑,而近年來傳統(tǒng)的魯米諾-雙氧水發(fā)光體系常使用的催化劑有辣根過氧化酶(HRP)、金納米材料、金屬硫族納米材料、碳納米材料。然而HRP這類天然蛋白酶本身不穩(wěn)定易失活且其修飾難度較大,而上述納米材料也不易修飾,限制了這些納米材料在魯米諾化學(xué)發(fā)光體系中的分析應(yīng)用。G-四鏈體DNA酶(G-quadruplex DNAzyme)作為一種新型的DNA酶,近幾年來受到了研究者的廣泛關(guān)注。這種人工酶具有類似于過氧化物酶的催化功能,在生理?xiàng)l件下,易功能化,且性能穩(wěn)定,在納米元件和生物傳感器的構(gòu)建中得到了重要的應(yīng)用,可以取代傳統(tǒng)的蛋白酶HRP,實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分子的信號(hào)放大檢測(cè)。目前,已報(bào)道的G-四鏈體DNA酶的分析應(yīng)用大多是用于催化雙氧水介導(dǎo)的氧化還原反應(yīng),例如3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、2,2-聯(lián)氮基-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨(ABTS)、魯米諾等,但是相較于前兩者,在魯米諾-雙氧水化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中的應(yīng)用具有一定的局限性。本文的創(chuàng)新之處是利用鉀離子(K+)和鉛離子(Pb2+)的核酸適配子形成的G-四鏈體DNA酶結(jié)合高靈敏度的化學(xué)發(fā)光技術(shù),實(shí)現(xiàn)了對(duì)K+和pb2+的高靈敏檢測(cè),并且成功用于生物實(shí)際樣的測(cè)定。進(jìn)一步擴(kuò)大了化學(xué)發(fā)光的分析應(yīng)用范圍,為化學(xué)發(fā)光在生化分析領(lǐng)域發(fā)展了新的檢測(cè)方法。具體內(nèi)容包括以下三個(gè)方面：(1)對(duì)K+的高靈敏檢測(cè)通過引入K+誘導(dǎo)的G-四鏈體DNA酶增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光,同時(shí)以K+為檢測(cè)目標(biāo),開發(fā)了一種基于脫氧核酸酶的高靈敏的K+化學(xué)發(fā)光分析方法。研究發(fā)現(xiàn),與其他金屬離子相比,只有K+能使核酸探針形成平行的G-四鏈體結(jié)構(gòu),從而與血晶素(hemin)發(fā)生較強(qiáng)的結(jié)合,形成具有較強(qiáng)催化功能的DNA酶,顯著增強(qiáng)了化學(xué)發(fā)光。結(jié)果表明,化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)的程度與K+的濃度在2-120μM之間呈良好的線性關(guān)系,檢測(cè)限為1.66μM。該方法靈敏度高、選擇性好,通過選擇合適的探針或者生物大分子,能夠進(jìn)一步用于其它靶標(biāo)的檢測(cè)。(2)對(duì)Pb2+的高靈敏檢測(cè)由于pb2+與上述DNA形成的G-四鏈體結(jié)合常數(shù)大于K+與G-四鏈體的結(jié)合常數(shù),并且Pb2+誘導(dǎo)DNA形成的是反平行的G-四鏈體,與hemin的結(jié)合能力很弱,不能得到G-四鏈體DNA酶。故在K+穩(wěn)定的平行G-四鏈體中引入pb2+,能誘導(dǎo)平行的G-四鏈體構(gòu)象發(fā)生變化而形成反平行的G-四鏈體,從而降低化學(xué)發(fā)光的強(qiáng)度。結(jié)果表明,其降低的程度與Pb2+的濃度的對(duì)數(shù)成線性關(guān)系,檢測(cè)限為0.06 nM,線性范圍是0.4-10 nM。該方法靈敏度高,并且成功用于頭發(fā)實(shí)際樣中Pb2+含量的檢測(cè)。(3)鉀-鉛調(diào)控的DNA邏輯門由于K+和pb2+分別誘導(dǎo)形成不同構(gòu)象的DNAG-四鏈體,導(dǎo)致DNA酶的催化能力不同,K+誘導(dǎo)的DNA酶能顯著增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光,pb2+誘導(dǎo)的DNA酶沒有增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光的功能。將K+和Pb2+作為兩個(gè)輸入信號(hào),化學(xué)發(fā)光作為輸出信號(hào),構(gòu)建一個(gè)雙輸入INHIBIT邏輯門。該邏輯門的建立能為化學(xué)發(fā)光法同時(shí)分析檢測(cè)K++和Pb2+設(shè)計(jì)計(jì)算程序提供參考。通過以上研究,我們成功的利用K+和pb2+誘導(dǎo)的G-四鏈體DNA酶發(fā)展了高靈敏檢測(cè)K+和Pb2+的方法,開拓了DNA酶在化學(xué)發(fā)光分析檢測(cè)方面的應(yīng)用,豐富了化學(xué)發(fā)光分析檢測(cè)對(duì)象,為更多的生物標(biāo)志物提供更加靈敏的檢測(cè)方法。
【關(guān)鍵詞】：G-四鏈體 DNA酶 化學(xué)發(fā)光 鉀離子 鉛離子 邏輯門
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：O657.3
【目錄】：

• 摘要8-10
• ABSTRACT10-12
• 縮寫符號(hào)對(duì)照表12-13
• 第1章 選題依據(jù)13-25
• 1.1 研究意義13-15
• 1.2 國內(nèi)外研究現(xiàn)狀及發(fā)展動(dòng)態(tài)分析15-22
• 1.2.1 G-四鏈體DNA酶的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)16
• 1.2.2 G-四鏈體構(gòu)型的多態(tài)性16-17
• 1.2.3 G-四鏈體DNA酶在分析化學(xué)中的應(yīng)用17-22
• 1.3 存在的主要問題22
• 1.4 本研究的目標(biāo)、內(nèi)容及擬解決的問題22-23
• 1.4.1 研究目標(biāo)22
• 1.4.2 研究內(nèi)容22-23
• 1.4.3 擬解決的問題23
• 1.5 研究方案及可行性分析23-24
• 1.5.1 研究方案23-24
• 1.5.2 可行性分析24
• 1.6 特色與創(chuàng)新24-25
• 第2章 K~+導(dǎo)的的G-四鏈體DNA酶催化化學(xué)發(fā)光高選擇性檢測(cè)K~+25-33
• 2.1 引言25-26
• 2.2 實(shí)驗(yàn)部分26-27
• 2.2.1 儀器26
• 2.2.2 試劑和藥品26
• 2.2.3 實(shí)驗(yàn)方法26-27
• 2.3 結(jié)果與討論27-31
• 2.3.1 K~+誘導(dǎo)DNA酶對(duì)魯米諾化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)27-28
• 2.3.2 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化28
• 2.3.3 K~+靈敏檢測(cè)28-29
• 2.3.4 選擇性考察29
• 2.3.5 人尿液中K~+的測(cè)定29-30
• 2.3.6 G-四聯(lián)體-hemin DNA酶的構(gòu)象表征30-31
• 2.4 本章小結(jié)31-33
• 第3章 Pb~(2+)替代G-四鏈體DNA酶中的K~+催化化學(xué)發(fā)光高靈敏檢測(cè)Pb~(2+)33-41
• 3.1 引言33-34
• 3.2 實(shí)驗(yàn)部分34-35
• 3.2.1 儀器34
• 3.2.2 試劑和藥品34
• 3.2.3 實(shí)驗(yàn)方法34-35
• 3.3 結(jié)果與討論35-39
• 3.3.1 Pb~(2+)誘導(dǎo)的DNA酶對(duì)魯米諾-雙氧水的化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)35-37
• 3.3.2 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化37-38
• 3.3.3 Pb~(2+)化學(xué)發(fā)光法的靈敏度和選擇性38-39
• 3.4 本章小結(jié)39-41
• 第4章 K~+Pb~(2+)調(diào)控的G-四鏈體DNA酶催化化學(xué)發(fā)光強(qiáng)信號(hào)的DNA邏輯門41-47
• 4.1 引言41
• 4.2 實(shí)驗(yàn)部分41-42
• 4.2.1 儀器41-42
• 4.2.2 試劑和藥品42
• 4.2.3 實(shí)驗(yàn)方法42
• 4.3 結(jié)果與討論42-45
• 4.3.1 構(gòu)建邏輯門DNA的選擇42-43
• 4.3.2 K~+和Pb~(2+)雙輸入INHIBIT DNA邏輯門43-44
• 4.3.3 Pb~(2+)和EDTA雙輸入的IMPLICATION DNA邏輯門44-45
• 4.4 本章小結(jié)45-47
• 第5章 全文總結(jié)及展望47-49
• 5.1 總結(jié)47
• 5.2 展望47-49
• 參考文獻(xiàn)49-57
• 碩士期間科研成果57-59
• 致謝59

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