【摘要】：高效、靈敏的生物分子定量分析檢測(cè)技術(shù)是現(xiàn)今分析化學(xué)研究領(lǐng)域中非常重要的研究課題之一,尤其在臨床診斷、食品安全、環(huán)境檢測(cè)等領(lǐng)域備受關(guān)注。電化學(xué)生物傳感器作為一種結(jié)合了電化學(xué)檢測(cè)信號(hào)與生物識(shí)別技術(shù)的分析策略,由于其靈敏度高、特異性好、成本低、響應(yīng)速度快等優(yōu)點(diǎn)而成為當(dāng)前分析檢測(cè)領(lǐng)域的明星研究策略之一,并于近幾十年來得到了廣大學(xué)者的大力發(fā)展和研究,取得了較好的應(yīng)用效果。當(dāng)前,在電化學(xué)生物傳感器的研究中,結(jié)合性能優(yōu)異的功能型納米材料,引入高效、簡(jiǎn)便、實(shí)用性強(qiáng)的信號(hào)放大技術(shù),大力發(fā)展新型電化學(xué)分析手段,在方法學(xué)層面開展新型電化學(xué)分析技術(shù)的研發(fā)工作及應(yīng)用工作,對(duì)于提高電化學(xué)生物傳感器的各項(xiàng)性能,實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)生物分子的高效、靈敏、特異性檢測(cè)具有非常重要的意義。本論文基于多種功能型納米材料,結(jié)合仿酶、核酸介導(dǎo)的生物信號(hào)放大策略,在研發(fā)高靈敏、低背景、實(shí)用性強(qiáng)的新型電化學(xué)生物傳感器上做了以下方法學(xué)層面的部分創(chuàng)新工作:1.基于樹枝狀DNA-Au@Pt納米結(jié)構(gòu)和卟啉錳電催化放大技術(shù)的超靈敏電化學(xué)適體傳感器傳統(tǒng)的卟啉錳電催化放大體系中廣泛使用的催化底物H_2O_2穩(wěn)定性較差,容易分解,從而對(duì)傳感器檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性及穩(wěn)定性造成一定的誤差。為解決這一問題,我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)具有硫醇結(jié)構(gòu)的L-半胱氨酸具有更為穩(wěn)定的化學(xué)活性,可以作為卟啉錳電催化反應(yīng)的催化底物�；贚-半胱氨酸作為催化底物的卟啉錳電催化反應(yīng)具有更為穩(wěn)定的催化反應(yīng)活性。為了進(jìn)一步提高該電催化放大反應(yīng)的放大效率,我們采用自組裝樹枝狀DNA-Au@Pt納米結(jié)構(gòu)同時(shí)固載電活性物質(zhì)硫堇和仿酶催化試劑卟啉錳,并進(jìn)一步將組裝的復(fù)合納米材料與凝血酶適體鏈偶聯(lián),作為目標(biāo)物凝血酶的信號(hào)探針,用于構(gòu)建凝血酶電化學(xué)適體傳感器。通過在自組裝樹枝狀DNA-Au@Pt納米結(jié)構(gòu)中的Au@Pt納米顆粒表面固載硫堇,并在其DNA雙鏈結(jié)構(gòu)中嵌入卟啉錳,使得卟啉錳對(duì)電解液中加入的催化底物L(fēng)-半胱氨酸的電催化反應(yīng)在電活性物質(zhì)硫堇的表面原位進(jìn)行,從而實(shí)現(xiàn)硫堇電化學(xué)信號(hào)的有效放大。在此基礎(chǔ)上構(gòu)建新型電化學(xué)適體傳感器,并應(yīng)用于對(duì)凝血酶的超靈敏分析。2.基于供-受體型光電材料及其信號(hào)增強(qiáng)劑復(fù)合納米囊材料的自增強(qiáng)型超靈敏光致電化學(xué)生物傳感器光致電化學(xué)生物傳感器為電化學(xué)生物傳感器的一個(gè)重要分支,因其低背景、高靈敏的優(yōu)點(diǎn)而在近年來備受關(guān)注,并得到大力發(fā)展。為提高光致電化學(xué)生物傳感器的靈敏度,可以借助提高光電材料的光電轉(zhuǎn)換效率從而增強(qiáng)傳感器的光電流信號(hào)的策略。本文構(gòu)建了一種具有顯著提高的光電轉(zhuǎn)換效率的分子內(nèi)自增強(qiáng)型的光電活性材料,并將之運(yùn)用于構(gòu)建自增強(qiáng)型光致電化學(xué)傳感器。通過制備一種同時(shí)大量包裹供-受體型光電活性材料PTB7-Th及其信號(hào)增強(qiáng)材料C_(60)納米顆粒的自增強(qiáng)型納米囊光電材料,結(jié)合目標(biāo)物雙循環(huán)放大策略,構(gòu)建自增強(qiáng)型光致電化學(xué)生物傳感器,并用于超靈敏檢測(cè)癌細(xì)胞中的microRNA-141。與傳統(tǒng)的采用分子間光電子傳遞方式的光電活性材料相比,本研究所提出的分子內(nèi)自增強(qiáng)型光電活性納米囊材料的光電流信號(hào)提高了約300倍。構(gòu)建的自增強(qiáng)型光致電化學(xué)生物傳感器具有顯著提高的光電轉(zhuǎn)換效率,簡(jiǎn)單的制備方式,優(yōu)良的穩(wěn)定性以及檢測(cè)過程中無需加入其它電子供體、受體或敏化劑的簡(jiǎn)單的操作步驟,為后續(xù)自增強(qiáng)型光致電化學(xué)生物傳感器的發(fā)展開辟了新的方向。3.基于目標(biāo)物-核酸轉(zhuǎn)換-放大策略及電子隧穿距離調(diào)控策略構(gòu)建通用型比率法光致電化學(xué)生物傳感器比率法分析技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)復(fù)雜生物樣本中低背景、高特異性的超靈敏檢測(cè)。然而,現(xiàn)有的光致電化學(xué)傳感器中,比率型的分析方法還極為有限。本文基于目標(biāo)物-核酸轉(zhuǎn)換-放大策略及電子隧穿距離調(diào)控策略構(gòu)建了一種通用型良好的比率型光致電化學(xué)生物傳感器,顯著提高了光致電化學(xué)傳感器的靈敏度及準(zhǔn)確性。采用兩種對(duì)于特定波長(zhǎng)具有選擇性響應(yīng)的光電活性材料CdS量子點(diǎn)(CdS QDs)和SiO_2@亞甲藍(lán)納米顆粒(SiO_2@MB NPs)同時(shí)作為目標(biāo)物的信號(hào)探針,通過目標(biāo)物-核酸轉(zhuǎn)換-放大策略將輸入的單個(gè)目標(biāo)物轉(zhuǎn)換成多個(gè)輸出核酸(product DNA),并通過product DNA調(diào)控電極表面四位體DNA納米結(jié)構(gòu)的形成,使得信號(hào)探針CdS QDs遠(yuǎn)離電極表面,而信號(hào)探針SiO_2@MB NPs靠近電極表面,從而同時(shí)得到一個(gè)降低的CdS QDs光電流信號(hào)以及增強(qiáng)的SiO_2@MB NPs光電流信號(hào)。計(jì)算兩種光電活性材料的光電流信號(hào)的比值可以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的比率型光致電化學(xué)檢測(cè)。本文所構(gòu)建的分析方法克服了現(xiàn)有的比率型光致電化學(xué)分析方法中目標(biāo)物對(duì)光電材料的高度依賴性,具有良好的通用性,可以廣泛應(yīng)用于如重金屬離子,microRNAs,DNAs,蛋白等多種類型目標(biāo)物的比率型檢測(cè),為將比率型光致電化學(xué)分析方法應(yīng)用于環(huán)境分析,臨床診斷,食品安全以及其他相關(guān)領(lǐng)域提供了新的思路。4.基于波長(zhǎng)選擇性光電活性材料構(gòu)建同一界面多組分檢測(cè)型光致電化學(xué)生物傳感器同一界面多組分檢測(cè)型分析方法可以有效的提高傳感器的檢測(cè)通量,縮短傳感器的檢測(cè)時(shí)間,提高傳感器的檢測(cè)效率。為提高光致電化學(xué)生物傳感器的檢測(cè)效率,本文篩選出了兩種對(duì)于特定波長(zhǎng)具有選擇性響應(yīng)的光電活性材料多壁碳納米管/硫堇復(fù)合物和二氧化鈦納米顆粒,并將其分別作為目標(biāo)物口腔癌核酸及p53核酸的光電活性探針構(gòu)建同一界面多目標(biāo)物同時(shí)檢測(cè)型光致電化學(xué)分析技術(shù),并將之應(yīng)用于藥物刺激下癌細(xì)胞中口腔癌核酸及p53核酸的體外檢測(cè)。采用酶輔助的目標(biāo)物循環(huán)放大策略進(jìn)一步提高檢測(cè)方法的靈敏度。為探討所構(gòu)建的多組分分析型光致電化學(xué)生物傳感器對(duì)于實(shí)際樣本的分析性能,實(shí)驗(yàn)采用構(gòu)建的傳感器進(jìn)一步對(duì)藥物姜黃素刺激下的HeLa細(xì)胞中口腔癌核酸及p53核酸的含量進(jìn)行定量檢測(cè)。本研究雖然僅僅以兩種核酸類物質(zhì)作為檢測(cè)的目標(biāo)物模型探討所構(gòu)建的光致電化學(xué)生物傳感器同一界面多目標(biāo)物的分析性能,但本方法亦可適用于其他如蛋白、細(xì)胞、重金屬離子等目標(biāo)物的同一界面多目標(biāo)物同時(shí)檢測(cè),為同一界面多目標(biāo)物同時(shí)分析型光致電化學(xué)分析方法的建立開辟了新的方向。5.基于近紅外光調(diào)控型光致電化學(xué)細(xì)胞表面蛋白分析技術(shù)及其體外藥物篩選應(yīng)用研究現(xiàn)有的藥物研發(fā)技術(shù)成本高昂,卻收效甚微。美國(guó)食品藥品管理局提出:在藥物研發(fā)的早期階段,發(fā)展更為靈敏、準(zhǔn)確、有效的體外藥物篩選技術(shù)是解決這一問題的關(guān)鍵。靈敏度高、背景信號(hào)低、便捷、低廉的光致電化學(xué)生物分析技術(shù)具有極大的潛在應(yīng)用價(jià)值,然而其檢測(cè)效率、檢測(cè)條件的生物相容性以及檢測(cè)方法的靈敏度等方面尚需進(jìn)一步改進(jìn)。為解決以上問題,本文構(gòu)建了一種可以應(yīng)用于細(xì)胞表面多種蛋白同時(shí)分析的光致電化學(xué)分析技術(shù),通過在近紅外光作用下同時(shí)高效檢測(cè)活細(xì)胞表面的凋亡指示因子磷脂酰絲氨酸蛋白(Pho)及穩(wěn)定表達(dá)的鈉鉀三磷酸腺苷酶蛋白(Sat)實(shí)現(xiàn)體外藥物篩選。通過組裝在近紅外光源下光電流信號(hào)逐漸較低的信標(biāo)探針(Tag_(kinetic))以及信號(hào)穩(wěn)定不變的信標(biāo)探針(Tag_(stable))用以分別指示Pho和Sat的含量,并對(duì)檢測(cè)到的混合光電流信號(hào)進(jìn)行數(shù)學(xué)解析,可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞表面蛋白Pho和Sat含量的檢測(cè)。計(jì)算待篩選藥物刺激下癌細(xì)胞表面Pho和Sat的數(shù)量比實(shí)現(xiàn)藥效評(píng)估及體外藥物篩選的目的。本文所構(gòu)建的方法不僅克服了現(xiàn)有的光致電化學(xué)多目標(biāo)物檢測(cè)技術(shù)中較差的生物相容性及實(shí)用性,更重要的是,我們所構(gòu)建的方法克服了現(xiàn)有基于熒光檢測(cè)的體外藥物篩選標(biāo)準(zhǔn)方法中熒光標(biāo)記探針難以避免的光漂白性及交叉反應(yīng)的缺點(diǎn),展現(xiàn)了顯著提高的準(zhǔn)確度及靈敏度,為構(gòu)建超靈敏、高準(zhǔn)確度、可操作性強(qiáng)、實(shí)用性好且成本低廉的體外藥物篩選技術(shù)提供了一條全新的道路。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：O657.1
【圖文】：

域的不斷進(jìn)步，發(fā)展具有更高的靈敏度、更快的響應(yīng)速度、更高的檢測(cè)效率以及更為便捷的檢測(cè)流程的電化學(xué)生物傳感器成為了其發(fā)展過程中的重要目標(biāo)和挑戰(zhàn)[5-7]。在電化學(xué)生物傳感器的研究中，構(gòu)建高效的檢測(cè)設(shè)備和檢測(cè)模式，發(fā)展新型的電化學(xué)檢測(cè)技術(shù)，結(jié)合具有獨(dú)特功能的前沿納米材料及高效、便捷的生物信號(hào)放大技術(shù)，對(duì)于提高電化學(xué)生物傳感器的實(shí)用性、靈敏度等各項(xiàng)性能具有重要的意義。1.1 電化學(xué)生物傳感器電化學(xué)生物傳感器是一門結(jié)合了電化學(xué)分析技術(shù)與生物學(xué)技術(shù)所發(fā)展起來的學(xué)科[8, 9]。由于融合電化學(xué)、醫(yī)學(xué)、生物科學(xué)、納米技術(shù)等眾多前沿科學(xué)，電化學(xué)生物傳感器在近年來得到了飛速的發(fā)展，具有較高的靈敏度、良好的特異性、快速的響應(yīng)速度、便捷的檢測(cè)方式、低廉的設(shè)備成本等優(yōu)點(diǎn)。電化學(xué)生物傳感器是依據(jù)生物傳感器中換能器的不同而進(jìn)行分類所產(chǎn)生的一個(gè)重要研究學(xué)科。如圖 1.1 所示，簡(jiǎn)單來說，電化學(xué)生物傳感器的工作原理是利用固載在傳感界面的生物識(shí)別原件對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行特異性識(shí)別，并通過工作站將生物識(shí)別信號(hào)轉(zhuǎn)換成為電流、電阻、電位、電容等可以檢測(cè)的輸出信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)傳感器對(duì)目標(biāo)物的特異性檢測(cè)[10]。

于方波伏安法的電化學(xué)生物傳感器用于檢測(cè)兩種目標(biāo)物的構(gòu)建原理tration of the aptamer/quantum-dot-based dual-analyte biosensor. Copyri抗型電化學(xué)生物傳感器阻抗譜（electrochemicalimpedancespectroscopy，EIS）又叫學(xué)阻抗譜的測(cè)定中，通過給電化學(xué)系統(tǒng)施加不同頻率的小振定交流信號(hào)電壓與電流間的比值（阻抗）隨正弦波頻率的變阻抗技術(shù)可以分析電極過程的動(dòng)力學(xué)、研究電極表面材料質(zhì)等。近年來，電化學(xué)阻抗譜作為一種飛速發(fā)展的電化學(xué)檢化學(xué)生物傳感器構(gòu)建過程中傳感界面的表征以及傳感器對(duì)[32, 33]。如圖 1.5 所示，賈能勤教授課題組研究并報(bào)道了一種胞傳感器用于檢測(cè)癌胚抗原陽性腫瘤細(xì)胞。采用一種三維（Au@BSA）微球修飾傳感界面以進(jìn)一步結(jié)合癌胚抗原陽性

第一章 緒論抗體。由于 Au@BSA 微球具有良好的導(dǎo)電性，傳感器的起始阻抗值較低，而當(dāng)目標(biāo)物存在時(shí)，目標(biāo)物細(xì)胞被傳感器表面的特異性抗體捕獲到電極表面，使得傳感界面的阻抗升高。通過檢測(cè)傳感界面阻抗的大小實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的檢測(cè)。傳感器對(duì)目標(biāo)物細(xì)胞的檢測(cè)范圍為 5.2×10 ~ 5.2×107cell/mL[34]。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 張兆霞;趙常志;;光致電化學(xué)分析及其傳感器的研究進(jìn)展[J];分析化學(xué);2013年03期

本文編號(hào)：2797927