【摘要】：蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子是生命體的物質(zhì)基礎(chǔ),與各項生命活動息息相關(guān)。對蛋白質(zhì)和核酸的結(jié)構(gòu)以及功能的研究,無疑對于了解生命活動規(guī)律、指導工業(yè)生產(chǎn)以及醫(yī)藥實踐都有著舉足輕重的作用。但是各種生化研究都要求被分析物具有足夠高的純度。因此,發(fā)展更加高效、簡單以及綠色的生物大分子的分離分析方法具有十分重要的意義。低共熔溶劑(Deep eutectic solvent,DES)作為一種新型綠色溶劑,由于具有原料來源豐富、合成簡單以及產(chǎn)物無需提純等優(yōu)點,與其他分離技術(shù)相結(jié)合被廣泛用于蛋白質(zhì)和核酸的純化。以低共熔溶劑作為成相劑所構(gòu)建的低共熔溶劑雙水相體系(Aqueous two-phase system,ATPS)有效地結(jié)合了低共熔溶劑和雙水相萃取技術(shù)的優(yōu)點,是一類具有良好生物相容性的萃取體系。低共熔溶劑磁性固相萃取技術(shù)(Magnetic solid-phase extraction,MSPE)是一種以低共熔溶劑改性的磁性材料作為萃取劑的固相萃取技術(shù),具有操作簡單、分離速度快和易于實現(xiàn)自動化的優(yōu)點。低共熔溶劑分子印跡技術(shù)(Molecular imprinted technology,MIT)是將低共熔溶劑作為功能單體,合成一種與模板分子的空間結(jié)構(gòu)和結(jié)合位點相匹配的聚合物的技術(shù),所制備的聚合物機械強度高、穩(wěn)定性好且使用壽命長。本研究設(shè)計合成了多種低共熔溶劑,分別結(jié)合雙水相萃取技術(shù)、磁性固相萃取技術(shù)和分子印跡技術(shù),建立了蛋白質(zhì)和DNA的分離純化新方法。主要研究內(nèi)容如下:(1)氯化膽堿類低共熔溶劑雙水相體系萃取蛋白質(zhì)合成了四種基于氯化膽堿的低共熔溶劑,結(jié)合無機鹽構(gòu)建雙水相體系用于蛋白質(zhì)的萃取分離。選擇牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)作為目標蛋白,氯化膽堿-甘油被選為最優(yōu)低共熔溶劑萃取劑。通過單因素實驗考察了低共熔溶劑的加入量、鹽濃度、蛋白質(zhì)的加入量、振蕩時間、溫度和pH值對蛋白質(zhì)萃取率的影響。在最佳萃取條件下,體系對牛血清白蛋白的萃取率可達98.16%,同時對胰蛋白酶(Trypsin,Try)也有高達94.36%的萃取率。反萃取實驗結(jié)果表明,牛血清白蛋白的反萃取效率可以達到32.96%。方法精密度、重復性和穩(wěn)定性驗證結(jié)果表明,該方法具有良好的精密度、重復性和穩(wěn)定性。紫外可見光譜(UV-vis spectrometry)、傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectrometry,FT-IR)和圓二色譜(Circular dichroism,CD)研究結(jié)果表明,蛋白質(zhì)的構(gòu)象在萃取過程中沒有發(fā)生改變。采用電導率測定法、動態(tài)光散射法(dynamic light scattering,DLS)和透射電子顯微鏡技術(shù)(transmission electron microscopy,TEM)探究了蛋白質(zhì)的萃取機理,結(jié)果表明低共熔溶劑和蛋白質(zhì)簇集物的形成在萃取過程中發(fā)揮了重要作用。本實驗所建立的方法為蛋白質(zhì)的萃取分離提供了一種新思路。(2)低共熔溶劑修飾的磁性氧化石墨烯固相萃取蛋白質(zhì)合成了四種基于氯化膽堿的低共熔溶劑,將其負載在氨基功能化的磁性氧化石墨烯(Fe_3O_4-NH_2@GO)表面,合成了Fe_3O_4-NH_2@GO@DES復合材料,并用于蛋白質(zhì)的磁性固相萃取。采用振動樣品磁強計(Vibrating sample magnetometer,VSM),X-射線衍射儀(X-ray diffraction,XRD)、傅里葉變換紅外光譜儀、熱重分析儀(Thermal gravimetric analysis,TGA)、場發(fā)射掃描電子顯微鏡(field emission scanning electron microscopy,FESEM)和zeta電位儀對Fe_3O_4-NH_2@GO@DES進行了表征。以牛血清白蛋白為目標蛋白,研究了Fe_3O_4-NH_2@GO@DES在萃取過程中的萃取性能。通過紫外可見分光光度計在278nm處測定牛血清白蛋白的濃度。與沒有低共熔溶劑修飾的磁性萃取劑相比較,Fe_3O_4-NH_2@GO@DES對牛血清白蛋白具有更高的萃取容量,可達44.59 mg/g。通過單因素實驗考察了pH值、溫度、萃取時間、蛋白質(zhì)濃度和Fe_3O_4-NH_2@GO@DES加入量對萃取過程的影響。以1 mol/L NaCl-0.1 mol/L Na_2HPO_4的水溶液作為洗脫液對含有牛血清白蛋白的萃取劑進行洗脫,洗脫率可達98.73%。圓二色譜研究結(jié)果表明,蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)在洗脫后沒有發(fā)生改變。實際樣品分析證明,Fe_3O_4-NH_2@GO@DES可以成功地從小牛血中萃取出牛血清白蛋白。方法重復性、精密度和穩(wěn)定性驗證結(jié)果表明,該方法具有良好的重復性、精密度和穩(wěn)定性。本實驗所建立的方法為蛋白質(zhì)的萃取分離提供了一種新思路。(3)新型聚合低共熔溶劑修飾的磁性二氧化硅復合物固相萃取胰蛋白酶合成了一種含雙鍵的氯化膽堿-衣康酸低共熔溶劑,通過乳液聚合反應將聚合低共熔溶劑(Polymeric deep eutectic solvent,PDES)包覆在γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(γ-methacryloxy propyl trimethoxy silane,γ-MPS)修飾的磁性二氧化硅(Fe_3O_4@SiO_2-MPS)表面,合成了Fe_3O_4@SiO_2-MPS@PDES復合材料。采用振動樣品磁強計、傅里葉變換紅外光譜儀、X-射線光電子能譜儀(X-ray photoelectron spectra,XPS)、熱重分析儀、透射電子顯微鏡和zeta電位儀對Fe_3O_4@SiO_2-MPS@PDES進行了表征。以胰蛋白酶為目標蛋白,研究了Fe_3O_4@SiO_2-MPS@PDES在萃取過程中的萃取性能。通過紫外可見分光光度計在278 nm處測定胰蛋白酶的濃度。通過單因素實驗探究了胰蛋白酶濃度、離子強度、pH值、萃取時間和溫度對萃取過程的影響。在最佳萃取條件下,Fe_3O_4@SiO_2-MPS@PDES對胰蛋白酶的萃取容量可達287.5 mg/g。與沒有修飾聚合低共熔溶劑的磁性萃取劑相比,Fe_3O_4@SiO_2-MPS@PDES對胰蛋白酶具有更高的萃取容量和選擇性。重復利用實驗表明,Fe_3O_4@SiO_2-MPS@PDES在重復利用八次后對胰蛋白酶仍有高達233 mg/g的萃取容量�；钚匝芯勘砻�,萃取后的胰蛋白酶活性保留了初始活性的96%。實際樣品分析證明,Fe_3O_4@SiO_2-MPS@PDES可用于牛胰臟粗提物中胰蛋白酶的分離純化。方法精密度、重復性和穩(wěn)定性驗證結(jié)果表明,該方法具有良好的精密度、重復性和穩(wěn)定性。本實驗所建立的方法為蛋白質(zhì)的萃取分離提供了一種新思路。(4)聚乙二醇類低共熔溶劑修飾的磁性殼聚糖多壁碳納米管固相萃取DNA合成了八種基于聚乙二醇的低共熔溶劑,將其包覆在殼聚糖修飾的磁性多壁碳納米管(mCS/MWCNT)表面,合成了DES-mCS/MWCNT復合材料,并用于鮭魚精DNA的磁性固相萃取。采用X-射線衍射儀、振動樣品磁強計、傅里葉變換紅外光譜儀、熱重分析儀、透射電子顯微鏡和zeta電位儀對DES-mCS/MWCNT進行了表征。通過單因素實驗考察了DNA濃度、離子強度、pH值、溫度和萃取時間對萃取過程的影響。在最佳萃取條件下,DES-mCS/MWCNT對DNA的萃取容量可達178 mg/g。與沒有低共熔溶劑修飾的磁性萃取劑相比,DES-mCS/MWCNT對DNA具有更高的萃取容量�；旌蠘悠份腿嶒灡砻�,DES-mCS/MWCNT可以從DNA和牛血紅蛋白(Bovine hemoglobin,BHb)的混合液中選擇性萃取DNA。以1 mol/L NaCl作為洗脫液對含有DNA的萃取劑進行洗脫,洗脫率可達79%。圓二色譜研究結(jié)果表明,DNA的二級結(jié)構(gòu)在洗脫后沒有發(fā)生改變。實際樣品分析證明,DES-mCS/MWCNT可以成功從小牛血中萃取出DNA。方法精密度、重復性和穩(wěn)定性驗證結(jié)果表明,該方法具有良好的精密度、重復性和穩(wěn)定性。本實驗所建立的方法為DNA的萃取分離提供了一種新思路。(5)基于低共熔溶劑的磁性分子印跡聚合物特異性識別溶菌酶以磁性二氧化硅(Fe_3O_4@SiO_2)為載體,以低共熔溶劑為功能單體,以溶菌酶(Lysozyme,Lys)為模板分子,通過表面分子印跡技術(shù)制備了磁性分子印跡聚合物(DES-Fe_3O_4@SiO_2-MIP),并用于溶菌酶的選擇性吸附。采用X-射線衍射儀、傅里葉變換紅外光譜儀、透射電子顯微鏡、熱重分析儀和振動樣品磁強計對DES-Fe_3O_4@SiO_2-MIP進行了表征。實驗探究了功能單體的種類和加入量對印跡聚合物的吸附性能的影響,結(jié)果表明,最佳聚合方案為選擇低共熔溶劑作為功能單體且單體加入量為100μL。熱力學吸附實驗和動力學吸附實驗結(jié)果表明,DES-Fe_3O_4@SiO_2-MIP可以在最適溶菌酶濃度1.2 mg/mL下7 h達到平衡,最大吸附量為108 mg/g,且其吸附等溫線符合Langmuir模型。選擇性吸附實驗表明,DES-Fe_3O_4@SiO_2-MIP可選擇性結(jié)合模板蛋白溶菌酶,印跡因子可達2.82,高于其他參比蛋白細胞色素c(Cytochrome c,Cyt c),牛血紅蛋白和牛血清白蛋白。競爭吸附實驗和實際樣品分析實驗結(jié)果表明,DES-Fe_3O_4@SiO_2-MIP可以從雙組份蛋白混合溶液和復雜樣品雞蛋清中特異性結(jié)合溶菌酶。重復利用實驗表明,DES-Fe_3O_4@SiO_2-MIP在重復使用四次后吸附容量僅有少量的降低。方法精密度和重復性驗證結(jié)果表明,該方法具有良好的精密度和重復性。本實驗所建立的方法為蛋白質(zhì)的選擇性分離提供了一種新思路。
【學位授予單位】：湖南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：O658;O629.7
【圖文】：

低共熔溶劑應用于生物大分子的分離分析研究1.1.2.1 氫鍵供體類低共熔溶劑這類低共熔溶劑是由有機鹽或無機鹽與氫鍵供體組成。其中有機鹽一般為季銨鹽和季擕鹽，氫鍵供體的種類主要包括多元醇、羧酸和酰胺類物質(zhì)。這類低共熔溶劑的形成機理是源于有機鹽中陰離子與氫鍵供體之間的氫鍵作用力。以氯化膽堿與醇類氫鍵供體的相互作用過程為例[9]，如圖 1.1 所示，可以看出氯化膽堿中 Cl-可以與氫鍵供體中的羥基 H 之間形成氫鍵連接。圖 1.2 列出了常見低共熔溶劑的季銨鹽/季擕鹽和氫鍵供體。

博士學位論文g(NO3)2·6H2O[10]和 LiNO3·3H2O[14]等。.1.3 低共熔溶劑的制備低共熔溶劑的制備只需一步加熱即可完成：將反應原料（鹽和氫鍵供體）一定摩爾比進行混合，加熱至形成透明均一、穩(wěn)定的液體。與離子液體的合比，低共熔溶劑的制備過程簡單、原料來源豐富、價格便宜、原子利用率高得產(chǎn)物無需進一步純化。圖 1.3 所示為氯化膽堿-尿素低共熔溶劑（摩爾比 1:合成過程。

血紅蛋白的結(jié)構(gòu)圖（圖片來自www.wikipedia.org）

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本文編號：2755905